SignalStar® Multiplex IHCでの空間プロファイリング
CSTのSignalStar Multiplex IHCアッセイキットは、カスタマイズ可能で柔軟性のある、高度に検証された空間生物学研究用の抗体パネルを提供します。
高い感度と特異性をもってFFPE組織内の複数の標的を同時に増幅し、わずか2日間で最大8種類の標的の結果を作成できます。
SignalStar Multiplex IHCとは？
SignalStar Multiplex IHC技術は、抗体やオリゴヌクレオチド、蛍光色素を用いて、細胞内における標的の存在量や局在、共発現パターンを調査する技術です。SignalStarアッセイは、組織内の空間的配置や構造を保持しつつ、複数のマーカーの表現型および機能を同時検出できます。細胞が、どのようにして組織化し、疾患進行や治療への応答を制御する組織微小環境に影響を与えるかを理解するためには、空間生物学におけるこれらの知見が不可欠です。
マルチプレックスIHCが空間プロファイリングを可能にする方法
マルチプレックスIHC (mIHC) は、汎用性のある空間生物学用の強力なツールであり、幅広い研究に用いられます。未変性状態の標的や細胞の理解、取得するデータ量の最大化、細胞機能の理解、RNA情報が不十分な場合のタンパク質の検出などを行う際に、mIHCは理想的なソリューションとなります。
未変性状態の生物学と機能の理解
マルチプレックスIHCは、1つの組織サンプル内で、リン酸化のようなタンパク質修飾を含む複数の表現型および機能的タンパク質標的を同時に検出することを可能にし、標的の本来の空間的および細胞的関係性を維持しながら、細胞や組織の根本的な機能についての知見を提供します。
取得するデータ量を最大化
マルチプレックスIHCでは、FFPEサンプルから得られるデータ量を最大化できるため、組織サンプルを追加する必要性が低減します。
翻訳後修飾に関するより深い知見を取得
RNA解析では、遺伝子発現に関する情報を得ることはできても、リン酸化やグリコシル化、アセチル化といったタンパク質の翻訳後修飾を捉えることはできません。マルチプレックスIHCにより、複数のタンパク質修飾の同時検出が可能となり、その背景にある生物学をより包括的に理解できます。
原理
SignalStar mIHCアッセイは、FFPE組織における最大8種類の標的の同時標識を可能にします。FFPE組織切片の脱パラフィン、再水和、抗原賦活化を行い (A)、希望のプレックスサイズ (3から最大8種類のオリゴ標識抗体) のすべての抗体を、1回の一次抗体インキュベーションステップの際に、同時に添加します (B)。蛍光色素 (チャンネル：488、594、647、750) 標識済みの相補的なオリゴヌクレオチドを用いて構築したオリゴ - 蛍光色素のコンストラクトを抗体に結合させて、1回目のイメージングラウンドで最大4種類のオリゴ標識抗体のシグナルを増幅させます (C-D)。プレックスサイズが4より大きい場合は、1回目のオリゴヌクレオチドと蛍光色素を穏やかに除去し (E)、2回目のイメージングラウンドで、最大4種類の追加のオリゴ標識抗体のシグナルを増幅させます (F)。その後、お手持ちのソフトウェアまたはオープンソースのソフトウェアを用いてコンピューター上で2つの画像を結合し、8プレックスの完全な画像を作成します (G)。
組織サンプルの調製
- 組織の採取と固定のプロセスは、サンプルの完全性と実験結果に直接影響するため大変重要です。組織の採取や保存、固定の方法は、サンプルや解析対象となるマーカーの分子によって異なります。
- マルチプレックスIHCのサンプル調製では、組織の構造や完全性を保持するために、ホルマリンなどのクロスリンク固定剤がよく利用されます。
抗原賦活化
- 固定剤は、組織サンプルの構造的完全性を保持する一方で、抗体が認識するエピトープをマスキングする可能性があります。
- 固定によりマスキングされたエピトープを露出させる方法には、タンパク質分解酵素を用いた方法や熱処理 (HIER) などがあります。
一次抗体のインキュベーション
弊社の手動または自動プロトコールにおいて、あらゆる組み合わせで機能することが検証済みの拡大中のIHC抗体リストから一次抗体をお選びいただけます。SignalStar標識抗体として利用可能な標的抗体が見つからない場合は、代わりに未標識のIHC検証済み抗体を一次抗体として選択し、その際にSignalStar®二次抗体を追加してください。これらのプロトコールは完全に検証されているため、パネルを簡単に設計および変更できます。
- 一度にすべての抗体を添加するため、抗体の染色サイクルを削減でき、複数回のイメージング中に生じるエピトープの損失やマスキングを心配する必要はありません。
- 抗体の添加後に10%中性緩衝ホルマリン液で短時間固定することにより、増幅やイメージング中も抗体をスライド上に維持することができます。
オリゴの増幅
- オリゴを用いて蛍光シグナルを増幅させるため、組織の自家蛍光をしのぐダイナミックレンジで幅広いバイオマーカーの検出が可能です。
- 1ラウンド目の4種類の各オリゴ標識抗体に特異的かつ相補的なオリゴヌクレオチドを添加し、その後蛍光標識オリゴを追加することにより、シグナルを指数関数的に増幅できます。
- スペクトル分離の必要性を低減するために、蛍光色素はスペクトルが明確に異なるものを使用します。
- 蛍光色素標識オリゴを穏やかに除去することにより、各抗体は無傷のままを保持した状態で、2ラウンド目の増幅とイメージングを行うことができます。
- どの抗体も、お客様固有の実験に適合するように、おおよそすべての蛍光色素と組み合わせることができます。
SignalStar Multiplex IHCでできること
わずか2日間でデータを作成
他の空間生物学マルチプレックス技術では、パネルの最適化と検証に数週間から数か月を要することがあります。SignalStar技術は、最適化されたready-to-goパネルにより、これらにかかる時間を最小化します。FFPE組織で使用可能なIHC検証済み抗体の拡大中の製品リストから、標的を選択してください。
SignalStarアッセイでは、1つの組織で最大8種類のタンパク質の蛍光シグナルを増幅します。これらの感度の高いアッセイでは、初回から必要なシグナルが得られるため、躊躇うことなく限られた貴重なFFPE組織サンプルを解析できます。
パラフィン包埋ヒト扁平上皮肺がん組織を、Pan-Keratin (C11) & CO-0003-488 SignalStar® Oligo-Antibody Pair #63566 (シアン)、CD68 (D4B9C) & CO-0007-594 SignalStar® Oligo-Antibody Pair #77318 (橙)、SIRPα/SHPS1 (D6I3M) & CO-0034-647 SignalStar® Oligo-Antibody Pair #80150 (ピンク)、CD163 (D6U1J) & CO-0022-750 SignalStar® Oligo-Antibody Pair #71043 (マゼンタ)、CD206/MRC1 (E2L9N) & CO-0035-488 SignalStar® Oligo-Antibody Pair #99626 (緑)、CD11c (D3V1E) & CO-0017-594 SignalStar® Oligo-Antibody Pair #85384 (黄)、CD45 (Intracellular Domain) (D9M8I) & CO-0013-647 SignalStar® Oligo-Antibody Pair #32740 (赤) およびHLA-DRA (E9R2Q) & CO-0023-750 SignalStar® Oligo-Antibody Pair #58446 (白) を用いてSignalStar免疫組織化学染色して解析しました。すべての蛍光色素に対し、記載した疑似カラーを割り当てています。マルチプレックス染色は、Leica Biosystems社のBOND RX自動染色装置で行いました。
パネルの設計を迅速化
弊社が提供する、オンラインの使いやすいSignalStar Multiplex IHCパネルビルダーが設計作業を行うため、お客様が作業をする必要はありません。プロトコールは検証済みであり必要な最適化は最小限であるため、すぐに実験ができます。
SignalStar技術は、構築したパネルに左右されることなく一貫性のある染色を行うことができます。プロトコールは検証および最適化済みのため、抗体の組み合わせや実験方法、イメージング装置が異なっていても、再現性のある結果が得られます。
組織マイクロアレイ内のパラフィン包埋ヒト甲状腺髄様がん組織を、SignalStarマルチプレックス免疫組織化学染色し解析しました。パネル 1：PD-L1 (E1L3N®) & CO-0005-647 SignalStar® Oligo-Antibody Pair #52085 (黄)、PD-1 (Intracellular Domain) (D4W2J) & CO-0008-594 SignalStar® Oligo-Antibody Pair #35347 (非表示)、CD68 (D4B9C) & CO-0007-488 SignalStar® Oligo-Antibody Pair #73071 (非表示)、and CD3ε (D7A6E) & CO-0001-750 SignalStar® Oligo-Antibody Pair #51754 (非表示)。 パネル 2：PD-L1 (E1L3N®) & CO-0005-647 SignalStar® Oligo-Antibody Pair #52085 (黄)、PD-1 (Intracellular Domain) (D4W2J) & CO-0008-594 SignalStar® Oligo-Antibody Pair #35347 (非表示)、CD68 (D4B9C) & CO-0007-488 SignalStar® Oligo-Antibody Pair #73071 (非表示)、and CD8 (D8A8Y) & CO-0004-750 SignalStar® Oligo-Antibody Pair #62750 (非表示)。 パネル 3: PD-L1 (E1L3N®) & CO-0005-647 SignalStar® Oligo-Antibody Pair #52085 (黄)、PD-1 (Intracellular Domain) (D4W2J) & CO-0008-594 SignalStar® Oligo-Antibody Pair #35347 (非表示)、Ki-67 (8D5) & CO-0014-488 SignalStar® Oligo-Antibody Pair #89034 (非表示)、and CD8ɑ (D8A8Y) & CO-0004-750 SignalStar® Oligo-Antibody Pair #62750 (非表示)。すべての蛍光色素に対し、記載した疑似カラーを割り当てています。マルチプレックス染色は、Leica Biosystems社のBOND RX自動染色装置で行いました。連続切片の同等の関心領域において、3種類のSignalStar 4プレックスパネルとPD-L1 (E1L3N®) & CO-0005-647 SignalStar® Oligo Antibody Pair #52085 (黄) を用いたシングルプレックスSignalStar染色およびPD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb #13684を用いた発色染色を行い、PD-L1陽性細胞の割合を定量および比較しました。
パネルの再設計が簡単
空間生物学に用いられるソリューションの多くは、変化する研究ニーズに対する柔軟性がありません。SignalStarパネルは、ニーズの変化に応じて簡単に標的を変更してパネルを再設計できる柔軟性を備えています。
シグナルを増幅
他の多くのソリューションとは異なり、SignalStarパネルはシグナルの増幅機能を備えています。そのため、発現レベルの低い標的を検出でき、これまで以上に多くの情報が得られます。
パラフィン包埋ヒト扁桃組織を、PD-1 (Intracellular Domain) (D4W2J) & CO-0008-647 SignalStar® Oligo-Antibody Pair #56837 (赤) およびProLong Gold Antifade Reagent with DAPI #8961 (青) を用いてSignalStarマルチプレックス免疫組織化学染色して解析し、Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4414、PD-1 (Intracellular Domain) (D4W2J) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate)、PD-1 (Intracellular Domain) (D4W2J) XP® Rabbit mAb #86163を用いて検出した結果と比較しました。すべての蛍光色素に対し、記載した疑似カラーを割り当てています。マルチプレックス染色は、Leica Biosystems社のBOND RX自動染色装置で行いました。PD-1陽性細胞の平均蛍光強度は、SignalStarアッセイ用の連続切片における同等の領域内で定量し、間接および直接発色法と比較しました。
いつでも再現可能
CSTは、SignalStarアッセイで抗体を検証しており、これらが期待通りに機能することを保証しています。すべてのSignalStar抗体は、ゴールドスタンダードである発色法で検証済みであり、異なる同様のサンプル間でも一貫した再現性を示します。
パラフィン包埋ヒト結腸直腸腺がん組織組織を、Pan-Keratin (C11) & CO-0003-488 SignalStar® Oligo-Antibody Pair #63566 (緑)、PD-L1 (E1L3N®) & CO-0005-594 SignalStar® Oligo-Antibody Pair #28249 (黄)、CD20 (E7B7T) & CO-0011-647 SignalStar® Oligo-Antibody Pair #36775 (赤)、およびCD8a (D8A8Y) & CO-0004-750 SignalStar® Oligo-Antibody Pair #62750 (シアン) を用いてSignalStarマルチプレックス免疫組織化学染色して解析しました。各マーカーの個別の染色像および結合した4プレックスの染色像を示しています。すべての蛍光色素に対し、記載した疑似カラーを割り当てています。マルチプレックス染色は、Leica Biosystems社のBOND RX自動染色装置で行いました。連続切片を用いたSignalStarアッセイ (n=2) から、同等の領域における陽性細胞率を定量して発色法と比較しました。
お手持ちの装置を活用
SignalStar mIHCパネルは、明確な発光ピークを持つ安定した蛍光シグナルを示すため、お手持ちの蛍光イメージング装置との互換性があります。
3-8プレックスのアッセイを行う際は、各チャンネル (488、594、647、750 nm) を持つ顕微鏡を用いてスライドをイメージングしてください。プロトコールの実行にかかる時間は6時間であり、4プレックス解析は1日で、8プレックスは2日間で染色およびイメージングを行うことができます。自動プロトコールの場合は、一晩で染色を完了できるため、作業時間を大きく削減できます。
抗体の染色サイクルを削減
エピトープの消失やマスキングを心配することなく、一度にすべての抗体を添加できます。
信頼性の高い結果
SignalStarパネルに用いられる個々の抗体は、使用を予定しているアプリケーションごとに独立して検証されており、信頼性と再現性のある結果を初回ならびに毎回提供するすべてのCST®抗体と同様に、期待通りに機能することが保証されています。
Cell Signaling Technology, CST, and SignalStar are trademarks of Cell Signaling Technology, Inc. Cy is a registered trademark of GE Healthcare. All other trademarks are the property of their respective owners. Visit cellsignal.com/legal/trademark-information for more information.
U.S. Patent No. 10,781,477, foreign equivalents, and child patents deriving therefrom.