InTraSeq™シングルセル解析のよくある質問

目的のタンパク質の発現が非常に少ないのはなぜですか？

シングルセルデータセットに含まれるダブレットやマルチプレットが、FeaturePlotでのタンパク質の可視化を阻害する場合があります。最大のカットオフ値 (max.cutoff) を使用することにより、許容範囲外の発現レベルが高いタンパク質を除外し、鮮明な可視化像を取得できます。このような場合は、「q90」またはより高いパラメーター (「q95」、「q99」など) の使用が適しているかもしれません。以下の太字部分を参照してください。

FeaturePlot(object, features = c("protein_Phospho-S6(Ser235-236)-Ab"), max.cutoff = “q90”, min.cutoff = "q5")

また、発表された論文を読んだり、公開されているデータベースを調べたりして、目的のタンパク質がサンプル中で発現していることを確認し、どのような条件がその発現を変化させる可能性があるかを知ることも重要です。

InTraSeq検証済みでない抗体を使用している場合は、抗体の結合が不十分となり、可視化が阻害される可能性があります。シングルセル実験を行う際は、CST® InTraSeq検証済み抗体を使用し、信頼性と再現性のある確実な結果を取得するためにInTraSeqプロトコールに従ってください。

目的のシグナル伝達経路がすべての細胞で観察されるのはなぜですか？

シグナル伝達経路に含まれる標的の多くは、普遍的に発現しており、様々な細胞タイプで検出されます。シグナル伝達経路のデータを解析または解釈する際には、適切なコントロール (ノックダウンやノックアウト、刺激、阻害など) を用いて実験をデザインしてください。

FeaturePlotのカラーグラデーションを使用することにより、シングルセルレベルのシグナル伝達経路の解析と解釈がより簡単になります。青 (低発現)、グレー (中発現)、赤 (高発現) を使用した以下の太字部分を参照してください：

FeaturePlot(your_object, features = c("protein_Phospho-CREB(Ser133)-Ab"), max.cutoff = "q95", min.cutoff = "q5") +
scale_color_gradientn(colours = c("#003C7B", "#73A9D2", "grey90", "#FDB393", "#b22222"))

InTraSeq技術においてメタノール固定ではどの程度RNAを良好に保存できますか？ メタノール固定はタンパク質検出に影響を与えますか？

CSTの科学者は、すべてのInTraSeq試薬とプロトコールを厳密に検証し、一貫して、確実にRNAが保存できることを確認しています。InTraSeq検証済み試薬を用いることにより、質の高いRNAシーケンシングの結果を取得し、細胞の不均一性を維持します。InTraSeq用標識抗体とプロトコールは、メタノール固定したサンプルで使用することを前提に開発および検証されており、InTraSeqプロトコールに従うことにより最高の機能を発揮します。

InTraSeq実験の後は、10x Genomics社のどの技術やプロトコールを使用すれば良いですか？

弊社のInTraSeq試薬とInTraSeqプロトコールは、10x Genomics Chromiumプラットフォームで使用できるように設計および検証されています。InTraSeqプロトコールの完了後は、Feature Barcoding技術を備えた10x Genomics Chromium Single Cell 3'キットを使用してください。詳細については、該当するユーザーガイドをご覧ください：CG000317、CG000206、またはCG000732。

InTraSeqの実験にもっと多くの標的を追加したいと思っています。カスタムメイドの標識抗体を注文できますか？

弊社は、シングルセル解析に使用可能な抗体を含む、CST一次抗体の幅広いカスタム標識抗体およびカスタム標識サービスを提供しています。

オリゴヌクレオチドを用いたカスタム標識抗体は、InTraSeq試薬での使用は検証されていないことにご注意ください。InTraSeq技術で使用するカスタム標識抗体の適切なタイトレーションと検証は、オプションで選択できます。

詳細は、カスタム標識抗体とカスタム標識サービスのウェブページをご覧いただくか、お近くの販売店にお問い合わせください。

シングルセルデータにダブレット/マルチプレットが数多く観察されるのはなぜですか？

メタノール固定バッファーの添加速度は、細胞の凝集に影響を与える可能性があります。InTraSeqプロトコールの細胞固定 (1日目) のステップ7では、メタノールを60秒以上かけて滴下することが非常に重要です。これを怠ると、ダブレットやマルチプレットが発生する可能性があります。

InTraSeqプロトコールの細胞の洗浄とカウント (3日目) のステップ8終了後も細胞の塊がみられる場合は、シングルセル実験に進む前にさらにピペッティングを行うことを推奨します。

InTraSeqプロトコール後に、細胞がすべて無くなってしまったのはなぜですか？

ステップB：ブロッキング (2日目) の開始以降、プロトコールが完了するまで、細胞を850 x g (RPMではありません) で遠心することが重要です。低速での遠心は、細胞の損失につながります。

また、ステップC：免疫染色 (2日目) の開始以降は、どのステップ中であっても、上清を除去する際は細胞ペレットが約40 µLの溶液に浸っていることが重要です。上清をすべて廃棄しようとすると、細胞を損失する可能性があります。

InTraSeq実験の前に、他社の標識抗体で免疫染色や細胞のハッシングを行うことはできますか？

InTraSeq実験の前に、標識抗体やハッシング試薬で生細胞を染色することは可能ですが、推奨しません。InTraSeq試薬を使用する際に、抗体の結合特性が変化する可能性があるため、弊社は、InTraSeq 3’用として検証されていない標識抗体をステップC：免疫染色 (2日目) で使用することを強く推奨します。

InTraSeq 3’プロトコールの前に免疫染色ステップを実施する場合、ステップ1で十分な数の細胞を保証するために、少なくとも200万個の細胞で免疫染色を開始することを強く推奨します。

InTraSeqライブラリーでは、1細胞あたり何リードを割り当てるべきですか？

InTraSeqタンパク質ライブラリーのリード数は、細胞当たり5,000リード以上であるべきです。

抗体カクテルに含まれる抗体の量はどれくらいですか？

カクテルに含まれる各抗体は、InTraSeqアッセイでバックグラウンドが最小限となり、確実なシグナルが得られるようにタイトレーションされています。

テクニカルサポート

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Cell Signaling Technology、CST、およびInTraSeqはCell Signaling Technology, Inc.の商標です。無断転用を禁じます。10x Genomics、10x、Feature BarcodeおよびChromiumは10x Genomics, Inc.の商標または登録商標です。その他の商標はすべて、それぞれの所有者に帰属します。詳細はcellsignal.com/trademarksをご覧ください。

Subject to patents licensed from 10x Genomics, Inc., for use with single-cell (i.e., Chromium) 10x products.