InTraSeq™ 3'プロトコール

InTraSeq™ 3'プロトコール

最適な結果を得るために：

• RNaseフリーで無菌の作業スペースでの実験を推奨します。
• フィルター付きピペットチップの使用を推奨します。
• セクションB. ブロッキング (2日目) 以降、プロトコールが完了するまで 850 x gで遠心することが重要です (rpmではありません)。
• セクションC. 免疫染色 (2日目) 以降は、上清を除去して廃棄する際に細胞ペレットを溶液 (約40 µL) に浸した状態を保つ ことが重要です。
• いずれのステップにおいても、上清を除去する際は、必ず真空吸引ではなくピペットを使用してください。
• 試薬を使用する前に、完全に解凍されていることを確認してください。

注意：

• InTraSeq™ 3' Assay Kitの構成品はすべて、フィーチャーバーコード標識技術を備えた10x Genomics社のChromium Single Cell 3' kitで検証されています。
• SAFE STOP：これは、実験操作を中断する必要がある場合に、プロトコールを安全に中断できるポイントを示します。
• このプロトコールは、InTraSeq™アッセイ (1サンプル) 用に設計されています。複数の サンプルを処理する場合は、すべての 量を比例して調整する必要があります。

溶液および試薬

キットの構成品 (-20°Cで保存)

• InTraSeq™ Blocking Buffer A #10471
• InTraSeq™ Blocking Buffer B #31701
• InTraSeq™ Staining Buffer #46005
• InTraSeq™ Wash Buffer #59335
• InTraSeq™ Reducing Agent #63760
• InTraSeq™ RNase Inhibitor #79298
• Rabbit (DA1E) Monoclonal Antibody IgG Isotype Control (InTraSeq™ 3' Conjugate 3000) #81472
• Histone H3 (D1H2) Rabbit Monoclonal Antibody (InTraSeq™ 3' Conjugate 3002) #68984

キットに含まれない必要な試薬

• InTraSeq™ 3' Conjugate/Antibody Cocktail
• 滅菌済み40 µm Falconセルストレーナー (2個)
• ボルテックスミキサー
• 1.5 mL滅菌済みポリプロピレン製微量遠心分離用チューブ (LoBindタイプ)
• 15 mL円錐底滅菌済みポリプロピレン製遠心分離用チューブ (LoBindタイプ推奨)
• 50 mL円錐底滅菌済みポリプロピレン製遠心分離用チューブ (LoBindタイプ推奨)
• Phosphate Buffered Saline (PBS-1X) pH7.2 (Sterile) #9872
• Methanol #13604
• Human Fc Receptor Blocking Solution #58948 (G4S Linker (E7O2V) Rabbit Monoclonal Antibody (InTraSeq™ 3' Conjugate 3118) #38470を使用する場合)
• Antibody Dilution Buffer #13616 (G4S Linker (E7O2V) Rabbit Monoclonal Antibody (InTraSeq™ 3' Conjugate 3118) #38470を使用する場合)

実験開始前の準備：

(オプション) キットが届いたら、InTraSeq™ Blocking Buffer Aを解凍し、ピペットで混合して 875 µLずつを8本の1.5 mL滅菌済み微量遠心分離用チューブに分注してください。

A. 細胞の固定 (1日目)

1. 100万 - 500万個の細胞をカウントして、15 mLチューブに移してください。G4S Linker (E7O2V) Rabbit Monoclonal Antibody (InTraSeq™ 3' Conjugate 3118) #38470を用いて免疫染色を実施する場合は、200万 - 500万個以上の細胞をカウントしてチューブに移してください。

   注意：100万個未満の細胞で実験を進めないでください。

2. 細胞を300 x gで5分間、4°Cで遠心分離してください。
3. 上清を除去して廃棄し、氷冷した1X PBS 10 mLで細胞を洗浄してください。
4. 細胞を300 x gで5分間、4°Cで遠心分離してください。
5. ステップ9に進んでください。G4S Linker (E7O2V) Rabbit Monoclonal Antibody (InTraSeq™ 3' Conjugate 3118) #38470を用いて免疫染色を実施する場合は、ステップ6に進んでください。
6. 200万 - 500万個の細胞をAntibody Dilution Buffer #13616 ( または0.5%ウシ血清アルブミンを含む1X PBS) 約100 µLに懸濁し、 細胞100万個あたり2.5 µgのHuman Fc Receptor Blocking Solution #58948を加えて室温で10分間処理してください。
7. G4S Linker (E7O2V) Rabbit Monoclonal Antibody (InTraSeq™ 3' Conjugate 3118) #38470 3 µLを加えて、4°Cで30分間 インキュベートしてください。
8. Antibody Dilution Buffer #13616 (または0.5%ウシ血清アルブミンを含む 1X PBS) 2 mLを細胞に加えてください。ピペットで細胞を懸濁してください。
9. 300 x gで5分間、4°Cで遠心分離した後、細胞ペレットを乱さないように上清を除去して廃棄してください。
10. ステップ8と9を2回繰り返し、合計3回洗浄してください。
11. 氷冷した1X PBS 0.5 mLで細胞を再懸濁してください。
12. ボルテックスミキサーの電源を入れて、スイッチを「オン」モード (「オート/タッチ」モードではありません) に設定し、低速 (ミキサーに応じて速度1-4程度) を維持してください。 サンプルが渦を巻くほど激しく攪拌されるのではなく、 サンプルが常に混合される程度を維持できるようにしてください。サンプルが激しく攪拌されてしまう場合は、ミキサーの速度を下げてください。

    注意：以下のステップ13では、氷冷したメタノールをゆっくりと (30秒以上かけて) 滴下することが非常に重要です。

13. ボルテックスミキサーのスイッチが「オン」になっていることを確認し、15 mLチューブをボルテックスミキサーの上に置いた後、 氷冷したメタノール4.5 mLをゆっくりと (30秒以上かけて) 滴下してください。
14. 細胞を-20°Cの冷凍庫で一晩インキュベートしてください。(SAFE STOP：サンプルは-20°Cの冷凍庫で最長7日間または -80°Cで最長14日間保存できます)

B. ブロッキング (2日目)

このセクション以降の各 遠心分離ステップでは、細胞を 850 x gでスピンダウンすることが重要です。スピンダウンの速度を下げると、細胞を損失する可能性があります 。

1. 以下の試薬を室温で解凍してください：
   • InTraSeq™ Wash Buffer：1ボトル
   • InTraSeq™ Blocking Buffer B
   • InTraSeq™ Blocking Buffer A：解凍し、ピペットで混合してください。
   • InTraSeq™ Staining Buffer：解凍し、ピペットで混合してください。
   • InTraSeq™ Reducing Agent：解凍し、沈殿物がなくなるまでボルテックスで混合してください。
2. 解凍後、各試薬を氷上で保持してください。
3. 加熱/冷却したInTraSeq™ Blocking Buffer Bを調製してください：
   1. InTraSeq™ Blocking Buffer B 130 µLを、1.5 mL滅菌済み微量遠心分離用チューブに分注してください。分注元のInTraSeq™ Blocking Buffer Bは、-20°Cの冷凍庫に戻してください。
   2. 分注したチューブを95°Cで5分間加熱してください。
   3. チューブをスピンダウンし、氷上で保持してください。この加熱/冷却したInTraSeq™ Blocking Buffer Bを、以下のステップで使用してください。
4. scBlock (下表を参照) を準備し、ピペットで混合してください。氷上で保持してください。

   scBlock	分量
   InTraSeq™ Blocking Buffer A	860 µL
   加熱/冷却したInTraSeq™ Blocking Buffer B	98 µL
   InTraSeq™ Reducing Agent	40 µL
   InTraSeq™ RNase Inhibitor	2 µL
   総量	1,000 µL

5. 細胞を850 x gで5分間、4°Cで遠心分離してください。
6. 上清を除去して廃棄し、細胞にscBlockを加えてください。ピペットで細胞を再懸濁させた後 、少なくとも30分間氷上で保持してください。
7. scBlock内でインキュベーションしている間に、以下のAntibody Master Mixを調製してください：
   1. 抗体の分量 (Vol. of Abs.) は、使用するInTraSeq™ 3' Antibody Cocktailおよび個々のInTraSeq™ 3' 標識抗体 (Ind. InTraSeq™ 3' Conj.またはInd. Conj.) の数に基づいて決定してください (下表 を参照してください)。総量は、最大30 µLです。

      	分量 (Cocktailのみ)	分量 (Ind. Conj.のみ)	分量 (Cocktail + Ind. Conj.)
      InTraSeq™ 3' Cocktail	5 µL (per cocktail)	N/A	___ µL (5 µL per cocktail)
      Ind. InTraSeq™ 3' Conj.	N/A	3 µL (per Ind. Conj.)	___ µL (3 µL per Ind. Conj.)
      Vol. of Abs.	___ µL	___ µL	___ µL

   2. Antibody Master Mixを、上で算出したVol. of Abs. (最大30 µL) をベースに調製してください (下表を参照してください)。気泡の発生を最小限に抑えるため、ピペットで穏やかに混合し、氷上で保持してください。

      Antibody Master Mix	分量 (Cocktailのみ)	分量 (Ind. Conj.のみ)	分量 (Cocktail + Ind. Conj.)
      Vol. of Abs.	___ µL	___ µL	___ µL
      InTraSeq™ Wash Buffer	30 µL - Vol. of Abs. (上の行 を参照)
      InTraSeq™ Staining Buffer	55 µL	55 µL	55 µL
      加熱/冷却したInTraSeq™ Blocking Buffer B	10 µL	10 µL	10 µL
      Rabbit (DA1E) Monoclonal Antibody IgG Isotype Control (InTraSeq™ 3' Conjugate 3000)	3 µL	3 µL	3 µL
      Histone H3 (D1H2) Rabbit Monoclonal Antibody (InTraSeq™ 3' Conjugate 3002) または その他のHistone H3 (D1H2) Rabbit Monoclonal Antibody (InTraSeq™ 3' Conjugate)	3 µL	3 µL	3 µL
      InTraSeq™ RNase Inhibitor	2 µL	2 µL	2 µL
      総量	103 µL	103 µL	103 µL

注意：Histone H3 (D1H2) InTraSeq 3' Conjugateを用いて複数のInTraSeqサンプルをマルチプレックス標識する場合は、ステップ8を開始する前に、各サンプルから同数の細胞をカウントして分注してください。

8. scBlock中で30分間インキュベーションした細胞に、InTraSeq™ Wash Buffer 2 mLを加えてピペットで混合してください。
9. 40 µm Falconセルストレーナーで細胞を濾過しながら50 mLチューブに移してください。

   注意：細胞回収率を最大限に高めるため、ストレーナーにピペット先端を軽く押し付けながら濾過してください (下の写真を参照してください)。

   
10. 濾過した細胞を新しい15 mLチューブに移し、すぐにセクション C. 免疫染色 (2日目) を開始してください。

    注意：残りのInTraSeq™ Wash Bufferは、3日目に使用するため 4°Cで保存してください。

C. 免疫染色 (2日目)

このセクション以降は、上清を除去して廃棄する際に、常に細胞ペレットを溶液 (約40 µL) に浸した状態を保つ ことが重要です。細胞を乾燥させると、RNAシグナルに悪影響を及ぼし、細胞の損失につながります。

実験開始前の準備：

1. 細胞を850 x gで5分間、4°Cで遠心分離してください。
2. チューブ内の液を約40 µL残して、上清を除去して廃棄してください。
3. Antibody Master Mix 100 µLを細胞に加えてください。ピペットで細胞を懸濁してください。
4. LoBindタイプの滅菌済み1.5 mL微量遠心分離用チューブに移し、4°Cで一晩 (約16時間) インキュベートしてください。

   注意：

   • 細胞を20時間以上インキュベートしないでください。
   • 4°Cで一晩インキュベートすることが重要です。

D. 細胞の洗浄とカウント (3日目)

実験開始前の準備：

• Modified InTraSeq™ Wash Bufferを調製してください。気泡の発生を最小限に抑えるため、ピペットで穏やかに混合し、氷上で保持してください。

  注意：分注元のボトルにInTraSeq™ Wash Bufferが残っている場合は、-20°Cで保存してください。

1. Modified InTraSeq™ Wash Buffer 1 mLを、細胞が入った1.5 mL微量遠心分離チューブに加えてください。 ピペットで混合した後、別の15 mLチューブに移してください。
2. Modified InTraSeq™ Wash Buffer 2 mLを加えて、総量を3 mLにしてください。
3. 850 x gで5分間、4°Cで遠心分離してください。チューブ内の液を 約40 µL 残して、上清を除去して廃棄してください。
4. Modified InTraSeq™ Wash Buffer 1 mLを加えてください。ピペットで細胞を再懸濁させた後、 Modified InTraSeq™ Wash Bufferをさらに3 mL加えて、総量を4 mLにしてください。
5. ステップ3-4を繰り返した後、細胞懸濁液4 mLを40 µm Falconセルストレーナーで濾過しながら50 mLチューブに移してください。 濾過した細胞を、新しい15 mLチューブに移してください。

   注意：細胞回収率を最大限に高めるため、ストレーナーにピペット先端を軽く押し付けながら濾過してください (下の写真を参照してください)。

   
6. 細胞を850 x gで5分間、4°Cで遠心分離してください。チューブ内の液を約40 µL 残して 、上清を除去して廃棄してください。
7. Modified InTraSeq™ Wash Buffer 100 µLを細胞に加えてください。ピペットで細胞を再懸濁した後、氷上で保持してください。

   注意：このステップ以降は、必要な希釈液を含め、細胞を Modified InTraSeq™ Wash Buffer内で保持してください。他のバッファーや溶液を使用すると、RNAが分解される可能性があります。

8. 細胞をカウントしてください。フィーチャーバーコード標識技術プロトコールを備えた10x Genomics社の Chromium Single Cell 3' Kitの細胞懸濁液分量計算表を参照して、希望する細胞濃度を決定してください。

   重要：細胞を目的の濃度に希釈する際は、Modified InTraSeq™ Wash Bufferのみを使用してください。

   注意：カウント後の細胞の凝集がみられる場合は、シングルセル実験に進む前に、ピペッティングでゆっくりと混合することを推奨します。

9. フィーチャーバーコード標識技術を備えた10x Genomics社のChromium Single Cell 3' Kitを用いて細胞を処理してください。

For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.