ヒストン修飾抗体の検証

ヒストン修飾を標的とする抗体は、標的と類似するけれども異なるヒストン修飾に非特異的に結合する可能性があります。逆に、隣接する残基の修飾に起因する立体障害により、抗体の特異的結合が阻害される可能性もあります。通常、ELISAやウェスタンブロット、ChIP、IFといったアッセイでは、抗体の特異性や感度を確認することはできますが抗体と近傍のエピトープの相互作用を明確に予測することはできません。したがって、ヒストン修飾を特異的に認識する抗体の検証には、これらのみでは不十分と言えます。

このような理由から、CSTの修飾特異的なヒストン抗体の検証には、Fuchs, S.M.らによるペプチドアレイアッセイと同様のアッセイ法が採用されています (1)。これらのアレイを用いることで、すべてのヒストンタンパク質の既知の修飾に対する反応性と単一修飾部位の検出に近傍の修飾が及ぼす影響を、1度の実験で評価できます。したがって、ペプチドアレイアッセイにより、抗体が期待通りに機能していることを確認できます。

アレイ

メチル化リジン (モノ、ジ、トリメチル化)、アセチル化リジンの単独修飾あるいは未修飾のリジンをもつペプチドを、ニトロセルロース膜にスポットしました。さらに、これらの修飾を、H3K4Me3やH3T3Phosといった既知の隣接したヒストン修飾と組み合わせたペプチドも同様にスポットしました (図を参照してください)。メチル化アルギニン抗体の試験にも、同様のアレイを使用しました。

抗体

図示すように、ヒストン修飾抗体を3種類の濃度でアレイにアプライしました。こうすることで、各アッセイで抗体濃度が飽和していないことを確認しながら反応性を評価できます。

解析

アレイを洗浄して蛍光標識二次抗体でインキュベートした後、LI-COR Odyssey赤外イメージング装置で蛍光を測定しました。

CSTが実施したヒストン修飾抗体の解析例については、下をクリックしてご覧ください。