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クロマチン免疫沈降のトラブルシューティングガイド

A. 予想されるクロマチン収量

組織サンプルからクロスリンククロマチンを調製する場合、組織の種類によってクロマチン収量が大きく異なります。下記の表には、4 x 106個のHeLa細胞の場合と比較しながら、25 mgの組織から調製した場合に予想されるクロマチン収量と、予想されるDNA濃度を示しています。これらの数値は、プロトコールのセクションIVに記載した方法で決定しています。

  • SimpleChIP® Enzymaticプロトコールでは、BD Medimachine system (BD Biosciences) またはDounce Homogenizerのどちらを用いて破砕処理を実施しても、クロマチン収量はほぼ同じでした。ただし、Medimachineを用いて破砕した組織サンプルでは、Dounce Homogenizerを用いた場合よりも免疫沈降効率が高くなりました。脳組織サンプルに関しては、Medimachineでは単細胞懸濁液になるまで十分に破砕することができないため、Dounce Homogenizerを使用してください。
  • SimpleChIP® Sonication Kitのプロトコールでは、すべての組織タイプで、Dounce Homogenizerの使用が推奨されます。

最適なChIPの結果を得るためには、免疫沈降1回あたり 5 - 10 µgの断片化済みのクロスリンクしたクロマチンが必要です。したがって、組織によっては、免疫沈降ごとに必要な組織量が25 mgを超えることがあります。

SimpleChIP® キット 酵素法 ソニケーション法
組織/細胞 クロマチンの総収量 予想されるDNA濃度 クロマチンの総収量 予想されるDNA濃度
組織/細胞 クロマチンの総収量 予想されるDNA濃度 クロマチンの総収量 予想されるDNA濃度
脾臓 20–30 µg/組織25 mg 200–300 µg/mL NT NT
肝臓 10–15 µg/組織25 mg 100–150 µg/mL 10–15 µg/組織25 mg 100–150 µg/mL
腎臓 8–10 µg/組織25 mg 80–100 µg/mL NT NT
脳 2–5 µg/組織25 mg 20–50 µg/mL 2–5 µg/
組織25 mg		 20–50 µg/mL
心臓 2–5 µg/組織25 mg 20–50 µg/mL 1.5–2.5 µg/組織25 mg 15-25 µg/mL
HeLa 10–15 µg/4 x 106細胞 100–150 µg/mL 10–15 µg/4 x 106細胞 100–150 µg/mL

NT=未試験

B. クロマチン断片化の最適化

SimpleChIP® Enzymatic Kitのプロトコールにおいて、クロスリンクしたクロマチンDNAを150 – 900 bpに断片化するための最適条件は、断片化に用いる組織や細胞の量に対するMicrococcal Nuclease量に大きく依存します。特定の組織または細胞タイプで、クロマチンの断片化の至適条件を決定するプロトコールを以下に示します。

  1. プロトコールのセクションI、II、IIIに記載の通り、125 mgの組織または2 x 107個の細胞 (5回分のIP調製分に相当) を用いて、クロスリンクした細胞核を調製してください。セクションIIIのステップ2の後、下記に進んでください。
  2. 細胞核調製液100 µLを1.5 mL遠心用チューブ5本に分注し、氷上に置いてください。
  3. Micrococcal Nuclease 3 µLを1X Buffer B + DTT混合液27 µLに加えてください (酵素を10倍に希釈)。
  4. ステップ2で用意した5本の各チューブに、希釈したMicrococcal Nuclease 0 µL、2.5 µL、5 µL、7.5 µL、10 µLを加え、チューブを数回転倒混和し、頻繁に撹拌しながら37℃で20分間インキュベートしてください。
  5. 0.5 M EDTA 10 µLを加えて断片化を停止させて、チューブを氷上に置いてください。
  6. 遠心用チューブで13,000 rpm、4℃で1分間遠心して細胞核を沈殿させて、上清を除去してください。
  7. 細胞核を1X ChIP buffer + PIC混合液200 μLに再懸濁します。氷上で10分間インキュベートします。
  8. ライセートを数回ソニケーション処理し、核膜を破砕してください。ソニケーション処理の合間は、サンプルを30秒間氷上でインキュベートしてください。細胞核を完全に溶解するために必要な最適条件は、ソニケーション処理の前後に細胞核を光学顕微鏡で観察して決定します。VirTis Virsonic 100 Ultrasonic Homogenizer/Sonicatorを6に設定し (1/8-inch probe)、20秒間のソニケーション処理を3回行うことで、HeLa細胞核は完全に溶解されます。代わりに、Dounce Homogenizerで20回ホモジナイズしても細胞核を破砕できますが、破砕が不完全になる可能性があります。
  9. 遠心用チューブで10,000 rpm、4℃で10分間遠心し、ライセートを浄化してください。
  10. ソニケーション処理した各ライセート50 µLを新しい遠心用チューブに移してください。
  11. 各サンプル50 µLに、nuclease-free water 100 µL、5 M NaCl 6 µL、RNAse A 2 µLを加え、ボルテックスにより混和し、37℃で30分間インキュベートしてください。
  12. RNAse Aで処理した各サンプルに、Proteinase K 2 µLを加え、ボルテックスにより混和し、65℃で2時間インキュベートしてください。
  13. 各サンプル20 µLを、100 bp DNAマーカーとともに1%アガロースゲルで電気泳動し、DNA断片のサイズを測定してださい。
  14. 得られたDNAが150 - 900 bp (1-6個のヌクレオソームに相当) の範囲になる断片化条件を確認してください。この最適化プロトコールを用いて検討した目的サイズのDNA断片を生じる希釈したMicrococcal Nucleaseの量は、目的サイズのDNA断片を生じる1回分の免疫沈降調製液 (破砕した組織 25 mg、または​ 4 x 106個の培養細胞) に加えられるMicrococcal Nuclease原液の10倍量に相当します。例えば、本プロトコールで希釈したMicrococcal Nuclease 5 µLにより150 - 900 bpのDNA断片が生じた場合、セクションIIIでクロマチンを断片化する際には1回分のIP調製液につき0.5 µLのMicrococcal Nuclease原液を加えることになります。
  15. 目的サイズのDNAが得られなかった場合は、断片化ごとにMicrococcal Nuclease量を調整しながら、本プロトコールを繰り返してください。もしくは、断片化時間を調整することでDNA断片化のサイズを最適化することができます。

SimpleChIP® Sonication Kitのプロトコールでは、クロスリンククロマチンDNAの断片化についての最適条件は、細胞数、サンプル量、ソニケーションの時間、使用するソニケーターパワーの設定により大きく異なります。各ソニケーションサンプルに対し、100 - 150 mgの組織または1 x 107 - 2 x 107個の細胞を、1 mLの ChIP Sonication Nuclear Lysis Bufferを使用することを推奨しています。特定の組織や細胞タイプで最適なソニケーション条件を決定するプロトコールを以下に示します。1X ChIP Buffer + PIC混合液200 μLで核ペレットを再懸濁します。氷上で10分間インキュベートします。

  1. セクションI、II、IIIに従い、100 - 150 mgの組織または1 x 107-2 x 107個の細胞を用いてクロスリンクした細胞核を調製してください。セクションIIIのステップ4を行った後、下記に進んでください。
  2. ソニケーションによるクロマチンの断片化：最適なソニケーション条件はソニケーターごとに異なり、出力設定に応じてソニケーションの回数と持続時間を調節する必要があります (Branson Digital Sonifier 250 probe sonicatorの推奨出力設定については、セクションIIIのステップ5をご参照ください)。最適なソニケーション条件を決定するには、ソニケーションのタイムコースを設定し、一定の回数または時間ソニケーションした後、50μLのクロマチンサンプルを採取してください。例えば、ソニケーション処理をしながら1 - 2分おきに、クロマチンサンプルを採取してください。
  3. ​21,000 x g、4℃で10分間遠心分離し、クロマチンサンプルを清澄化してください。
  4. 上清を新しい遠心分離用チューブに移し、100 ​μLのNuclease-free water、6 μLの5 M NaCl #7010と、2 μLのRNAse A #7013を加えます。ボルテックスで混和し、37℃で30分間インキュベートしてください。
  5. 各サンプルに、2 μLの#10012 Proteinase Kを加えます。ボルテックスにより混和し、65℃で2時間インキュベートしてください。
  6. 各サンプル20 µLを、100 bp DNAマーカーとともに1%アガロースゲルで電気泳動し、DNA断片のサイズを測定してださい。
  7. 最適なDNA断片サイズが得られるソニケーション条件を選択して (下記注釈参照)、セクションIIIのステップ5のクロマチン調製に用いてください。最適なソニケーション条件が得られない場合は、ソニケーターの出力設定を増減してソニケーションのタイムコースの検討を繰り返してください。

注意：最適なソニケーション条件はサンプルの種類や固定時間によって異なります。推奨されるサイズのクロマチン断片を得るために必要な、最小回数のソニケーションを行うようにしてください。長さが 500 bp未満のDNA断片が全体の80%を超えるような過剰なソニケーションを行うと、クロマチンに過度のダメージを与え、免疫沈降の効率が低下する恐れがあります。

  • 10分間固定した細胞の場合、最適なソニケーション条件下では、DNA断片全体の約90%が1 kb未満のスメア状のバンドとして観察されます。固定時間を30分に延長すると断片化の効率が低下し、1 kb未満のスメア状のバンドとして観察されるDNA断片は約60%となります。
  • 10分間固定した組織の場合、最適なソニケーション条件下では、DNA断片全体の約60%が1 kb未満のスメア状のバンドとして観察されます。固定時間を30分に延長すると断片化の効率が低下し、1 kb未満のスメア状のバンドとして観察されるDNA断片は約30%となります。

C. トラブルシューティングガイド

問題考えられる原因推奨される対処法
問題考えられる原因推奨される対処法
1. 断片化DNAの濃度が低すぎる。クロマチン調製用の細胞量や組織量が十分でない、または細胞/組織の溶解が不完全である。クロマチン調製液のDNA濃度が50 μg/mLに近い場合、1回の免疫沈降あたり少なくとも5 μgとなるようにさらにクロマチンサンプルを追加し、プロトコールに従って実験を続けてください。
クロスリンクの前に、別途用意したプレートで細胞数を数え、正確な細胞数を測定してください。
酵素法：ソニケーションの前後に顕微鏡で観察し、細胞核が完全に溶解していることを確認してください。
2. クロマチンの断片化が不十分で、DNA断片が大きすぎる。大きなクロマチン断片が原因でバックグラウンドが高くなり、解像度が低くなる可能性があります。細胞のクロスリンクが過剰、または用いたサンプル量 (細胞/組織) が多すぎる。クロスリンク時間を10 – 30分の範囲内で短くする、またはソニケーション1回ごとの細胞/組織の量を減らす、これらのいずれかまたは両方を行ってください。
酵素法：クロマチンの断片化に用いるMicrococcal nucleaseの量を増やしてください。または酵素消化のタイムコース実験を行ってください。
ソニケーション法：ソニケーションのタイムコース実験を行ってください。
3. クロマチンの断片化が進行しすぎている。ヌクレオソーム1個分のDNAの長さになるまでクロマチンを完全に断片化すると、特に長さが150 bp以上のアンプリコンの場合、PCR定量にてシグナルが減弱する可能性があります。クロマチンの過剰なソニケーション処理によって、クロマチンの完全性が損なわれ、抗体エピトープが変性する可能性があります。酵素法：断片化に加えた細胞数が十分でないか、またはMicrococcal Nuclease量が過剰。酵素法：クロスリンク前に組織を計量、または別途用意したプレートの細胞数を数え、正確な細胞数を測定してください。クロマチンの断片化に加える組織または細胞を増やすか、またはMicrococcal Nuclease量を減らしてください。
​ソニケーション法：調製条件が厳しすぎる。ソニケーションのタイムコース実験を行い、適切な断片サイズを得るための最低限の処理時間を確認してください。
4. インプットDNAのPCR反応で産物が得られない、または得られる量が非常に少ない。PCR反応に使用したDNA量が十分でない、またはPCR条件が最適でない。PCR反応により多くのDNAを使用するか、サイクル数を増加させてください。クロスリンクした断片化クロマチンから精製したDNAを用いて、プライマーのPCR条件を最適化してください。
PCRの増幅領域が、ヌクレオソームフリー領域に及んでいる。アンプリコンの長さが150 bp未満になるように、別のプライマーセットを設計してください。
免疫沈降に使用したクロマチン量が十分でないか、またはクロマチンの断片化が進行しすぎています。最適なChIP結果を得るために、各免疫沈降あたりクロマチン5 – 10 μgを加えてください。上記1、3の対応策も参照してください。
5. ポジティブコントロールであるHistone H3抗体の免疫沈降サンプルとRPL30プライマーを用いたPCR反応で増幅が起こらない。免疫沈降に加えたクロマチンまたは抗体が十分でない、または免疫沈降のインキュベーション時間が短すぎる。各免疫沈降サンプルにクロマチン5 – 10 μgと抗体10 μLを加えて一晩インキュベートし、Protein Gビーズを加えてさらに2時間インキュベートしてください。
Protein Gビーズからのクロマチンの溶出が不十分である。Protein Gビーズからのクロマチンの溶出には65°Cが最適で、頻繁に撹拌してビーズの懸濁状態を保ってください。
6. ネガティブコントロールのRabbit IgGの免疫沈降産物と、ポジティブコントロールのHistone H3抗体の免疫沈降産物で、PCRでの増幅が同程度になる。免疫沈降に使用したクロマチン量が過剰、または十分でない。あるいは、免疫沈降に抗体を加えすぎている。各免疫沈降反応に対して加える量は、クロマチン15 μg、Histone H3 antibody 10 μLを上限としてください。Normal rabbit IgG量を一回のIPあたり1 μLまで減らしてください。
PCR反応に加えたDNAが多すぎる、またはサイクル数が多すぎる。PCR反応に加えるDNAを減らすか、PCRのサイクル数を減らしてください。定量を正確に行うためには、PCRの線形増幅領域内でPCR産物を解析することが非常に重要です。
7. 解析したい標的の抗体の免疫沈降産物で、PCR反応による増幅が起こらない。PCR反応に加えたDNA量が十分でない。PCR反応により多くのDNAを使用するか、サイクル数を増加させてください。
免疫沈降に使用した抗体量が十分でない。通常は免疫沈降反応液に1 – 5 μgの抗体を加えますが、実際に必要な量は抗体によって大きく異なります。免疫沈降反応液に加える抗体の量を増やしてください。
免疫沈降では作用しない抗体である。ChIP検証済みの、別の抗体を検討してください。

作成日：2008年3月

改訂日：2017年5月

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