ホーム /
学術情報 & サポート /
プロトコール /
SignalStar™マルチプレックス免疫組織化学染色アッセイマニュアル

SignalStar™マルチプレックス免疫組織化学染色アッセイマニュアル

製品情報：

保存：キットのすべての構成品を-20°Cで保存してください。

安定性：キットのすべての構成品は、推奨された温度で保存した場合、少なくとも12か月間安定性を維持します。5回を超える凍結/解凍サイクルは、行わないでください。

適用：SignalStarキットは、蛍光マルチプレックス免疫組織化学染色を行う際にご使用いただけます。

スライド数：このキットには、10枚のスライドの染色に必要な材料が含まれています。

1 はじめに：SignalStar™染色の方法論
2 溶液および試薬
- 2.1 キットに含まれる構成品
- 2.2 キットに含まれない必要な試薬
3 開始前の重要な考慮事項
4 SignalStarイメージングラウンド1：溶液の調製
5 SignalStarイメージングラウンド1：使用プロトコール
6 SignalStarイメージングラウンド2：溶液の調製
7 SignalStarイメージングラウンド2：使用プロトコール
8 ユーザーワークシート
9 Appendix
- 9.1 SignalStarパネルデザインの例
- 9.2 トラブルシューティングとよくある質問

1 はじめに：SignalStar™染色の方法論

SignalStar™マルチプレックス免疫組織化学染色 (mIHC) は、抗体やオリゴヌクレオチド (オリゴ)、蛍光色素を用いて細胞内での存在や局在、機能、バイオマーカーとの共発現パターンを調査するための技術です。SignalStar技術は、空間的な配置と組織の構造を保持しつつ、複数の標的の表現型および機能を検出できます。細胞が、どのようにして組織化し、疾患進行や治療への応答を制御する組織の微小環境に影響を与えるかを理解するためには、これらの知見が不可欠です。

SignalStarシステムの能力の源は、SignalStarに用いる抗体のデザインに存在します。これらの抗体は、ホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 組織で用いるために厳密に検証されており、その後、部位特異的な標識と徹底した精製法を用いて各オリゴヌクレオチド (オリゴ) タグに結合させます。高度に特異的な、相補的オリゴのネットワークと蛍光色素を用いることにより、科学者は、存在量が低いものも含めて3-8種類の標的のシグナルを増幅できます。

SignalStar Multiplex IHC WorkFlow Diagram

図1. ご希望のプレックスサイズ (最大3-8種類のオリゴ標識抗体) のすべての抗体のカクテルを、1回の一次抗体インキュベーションステップの際に同時に添加してください。蛍光色素標識済みの相補的オリゴ (チャンネル：488、594、647、750) を用いて、オリゴ-蛍光色素のコンストラクトを構築して抗体に結合させることにより、1回目のイメージングラウンドで最大4種類のオリゴ標識抗体のシグナルが増幅できます。プレックスのサイズが4より大きい場合は、1ラウンド目のオリゴと蛍光色素を穏やかに除去し、2ラウンド目で、最大4種類の追加のオリゴ標識抗体を可視化するための増幅を行います。この相補的なオリゴシステムと蛍光色素の除去プロセスにより、交差反応を示すことなく、同じ基質を用いて2ラウンド目の抗体シグナルを増幅できます。その後、2つの画像を、専用またはオープンソースのソフトウェアを用いてコンピューター上で位置合わせして結合し、最大8種類の標的を含む画像を作成します。

2 溶液および試薬

2.1 キットに含まれる構成品

キットに含まれる構成品

最大8種類のSignalStarオリゴ標識抗体 (以下を参照)

最大8種類のSignalStar相補的オリゴ (以下を参照)

SignalStar™ Antibody Diluent A

SignalStar™ Antibody Diluent B

SignalStar™ Amplification Buffer A

SignalStar™ Amplification Buffer B

SignalStar™ Amplification Oligo Set A：

488

594

647

750

SignalStar™ Amplification Oligo Set B：

488

594

647

750

SignalStar™ Ligation Buffer

T4 DNA Ligase (5 U/µL)

ATP (100 mM)

10X dsDNase Buffer

dsDNase

キットには、ご注文時にお選びいただいた最大8種類のSignalStarオリゴ標識抗体 (A) および最大8種類のSignalStar相補的オリゴ (B) が含まれており、これらはオリゴ-抗体ペア (C) として共に梱包されています。以下の例を参照してください。

SignalStar Oligo Antibodies

2.2 キットに含まれない必要な試薬

SignalStain^® EDTA Unmasking Solution (10X) #14747
キシレン (脱パラフィン用)
エタノール、無水変性、病理学グレード (100%および95%)
Decloaking Chamber (自動抗原賦活化装置) (Biocare Medical社、#DC2012)
Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997
DAPI #4083
ProLong Gold Antifade Reagent #9071
Nuclease-free Water #12931
10%中性緩衝ホルマリン液
低吸着ピペットチップ
スライド処理コンテナ
撥水性バリアペン
カバースリップ
帯電スライド
コントロール組織

3 開始前の重要な考慮事項

実験の開始前に、溶液調製のステップおよびプロトコール全体をお読みください。

同じ蛍光チャンネルの相補的オリゴを組み合わせないでください。1回のイメージングラウンドに含めることができる、各蛍光チャンネルの相補的オリゴは1つのみです。同じイメージングラウンドで同じ蛍光チャンネルに特異的な相補的オリゴを組み合わせると、アッセイの結果が解釈不能になる可能性があります。

異なるパネルの抗体を組み合わせないでください。同時に複数のパネルを実行する場合は、パネルごとに個別の抗体/相補的オリゴの混合物を作成する必要があります。

一部のSignalStarキットの構成品には粘性があります。溶液量が正確に測定されていない場合、または十分に混合されていない場合、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。低吸着ピペットチップを用いて、SignalStarキットの構成品を15 mLコニカルチューブに入れて混合してください。正確性を確保するために、ゆっくりとピペッティングしてください。室温で20分間、転倒混和してください。使用時以外は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保持してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保持して速やかに使用してください。

SignalStarパネルデザインで、2ラウンドのイメージングが必要か否かを確認してください。このページのセクション9.1および8.1に記載しているSignalStarパネルデザインの例とSignalStarパネルデザインワークシートをお役立てください。

染色が完了してから8時間以内にスライドのイメージングを行ってください。この時間内にスライドのイメージングが行われない場合、蛍光シグナルが消失する可能性があります。

使用を予定している顕微鏡が、本キットに含まれる蛍光色素を検出できるかを確認してください。イメージングの際に、DAPIに加えて4種類の蛍光チャンネルを取得する必要があります。

蛍光チャンネル	励起波長 (nm)	蛍光波長 (nm)	レーザー線	一般的なフィルターセット
488	488	520	488	FITC
594	590	618	561/594	Texas Red
647	650	668	594/633	Cy^®5
750	752	776	633	Cy^®7

単染色したスライドを上記のスペクトルでイメージングし、スペクトルライブラリーを作成することを推奨します。これにより、スペクトルの漏れ込みの最小化に役立つ、スペクトルの分離が可能になります。

DAPIを含む封入剤ではなく、DAPI濃縮液の使用を推奨します。明るいDAPI染色は、より正確な画像の位置合わせを可能にします。

このプロトコールから逸脱した場合、結果は保証できません。SignalStarプロトコールは、指定された抗原賦活化と染色ステップに合わせて開発および最適化されています。

ポジティブコントロールスライドの使用を推奨します。マルチプレックスパネル内のすべての標的が存在することが発色染色で確認済みの組織を、各染色に含めることを推奨します。

各抗体を1:100で使用することを推奨します。ただし、1:50または1:200のどちらの希釈率で使用した場合でも十分な量の抗体試薬を提供しています。

染色プロセスの間では、スライドを乾燥させない程度に、可能な限りインキュベーション溶液とdH₂Oを吸引除去してください。次のステップに進む前に、各ステップの最後にスライドから液体を振り落としてください。

次のSignalStarキット構成品は、使用前に一晩4℃で解凍できます。

SignalStar™ Antibody Diluent A
SignalStar™ Antibody Diluent B
SignalStar™ Amplification Buffer A
SignalStar™ Amplification Buffer B
SignalStar™ Ligation Buffer

4 SignalStarイメージングラウンド1：溶液の調製

	各溶液は、調製後すぐに使用してください。溶液の調製前に、セクション5の「SignalStarイメージングラウンド1：使用プロトコール」をお読みください。
	SignalStarキット構成品は、特別な記載がない限り使用直前に室温で解凍し、その後、使用中は氷上で保持してください。

4.1 イメージングラウンド1：SignalStar Solution

調製後のSignalStar Imaging Round 1 Solutionには、キットのご注文時にお選びいただいたすべての抗体 (イメージングラウンド1とイメージングラウンド2を合わせて最大8種類) と、イメージングラウンド1の相補的オリゴが含まれている必要があります。このページのセクション9.1および8.1に記載しているSignalStarパネルデザインの例とSignalStarパネルデザインワークシートをお役立てください。

同じ蛍光チャンネルの相補的オリゴを組み合わせないでください。イメージングラウンド1およびイメージングラウンド2に用いる相補的オリゴを混合しないでください。

SignalStar Antibody Diluentには粘性があります。溶液量が正確に測定されていない場合、または十分に混合されていない場合、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。低吸着ピペットチップを用いて、SignalStarキットの構成品を15 mLコニカルチューブに入れて混合してください。正確性を確保するために、ゆっくりとピペッティングしてください。室温で20分間、転倒混和してください。使用時以外は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保持してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保持して速やかに使用してください。

キット構成品	必要な容量
キット構成品	5スライド (µL)	10スライド (µL)
SignalStar Antibody Diluent A	525	1,050
SignalStar Antibody Diluent B	225	450
各SignalStarオリゴ標識抗体	7.5	15
各イメージングラウンド1：SignalStar Complementary Oligo	7.5	15
総量	最大840	最大1,680

4.2 イメージングラウンド1：SignalStar Amplification Solution 1

SignalStar Amplification Bufferは粘性があります。溶液量が正確に測定されていない場合、または十分に混合されていない場合、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。低吸着ピペットチップを用いて、SignalStarキットの構成品を15 mLコニカルチューブに入れて混合してください。正確性を確保するために、ゆっくりとピペッティングしてください。室温で20分間、転倒混和してください。使用時以外は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保持してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保持して速やかに使用してください。

キット構成品	必要な容量
キット構成品	5スライド (µL)	10スライド (µL)
SignalStar Amplification Buffer A	3,000	6,000
SignalStar Amplification Buffer B	3,000	6,000
SignalStar Amplification Oligo A-488	60	120
SignalStar Amplification Oligo A-594	60	120
SignalStar Amplification Oligo A-647	60	120
SignalStar Amplification Oligo A-750	60	120
総量	6,240	12,480

4.3 イメージングラウンド1：SignalStar Amplification Solution 2

キット構成品	必要な容量
キット構成品	5スライド (µL)	10スライド (µL)
SignalStar Amplification Buffer A	3,000	6,000
SignalStar Amplification Buffer B	3,000	6,000
SignalStar Amplification Oligo B-488	60	120
SignalStar Amplification Oligo B-594	60	120
SignalStar Amplification Oligo B-647	60	120
SignalStar Amplification Oligo B-750	60	120
総量	6,240	12,480

4.4 イメージングラウンド1：SignalStar Ligation Solution

溶液を調製する際は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保持してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保持して速やかに使用してください。

キット構成品/試薬	必要な容量
キット構成品/試薬	5スライド (µL)	10スライド (µL)
SignalStar Ligation Buffer	375	750
Nuclease-free Water #12931	352.5	705
T4 DNA Ligase (5 U/µL)	15	30
ATP (100 mM)	7.5	15
総量	750	1,500

4.5 キットに含まれない、追加で用意する必要がある溶液

1X EDTA Unmasking Solution：250 mLの1X EDTA Unmasking Solutionを調製する場合、25 mLのSignalStain^® EDTA Unmasking Solution (10X) #14747を225 mLの精製水 (dH₂O) で希釈してください。
10%中性緩衝ホルマリン液
1X Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST)：1 Lの1X TBSTを調製する場合、10 mLのTris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997を、900 mLのdH₂Oに加え、攪拌してください。

5 SignalStarイメージングラウンド1：使用プロトコール

各溶液は、調製後すぐに使用してください。溶液の調製前に、セクション5の「SignalStarイメージングラウンド1：使用プロトコール」をお読みください。

5.1 スライドベーキング

	スライドベーキングは、実験開始の前日に行うことができます。このステップでは、パラフィンワックスを融解させ、組織をスライドにより強く接着させます。
	1. スライドを60°Cで30分間インキュベートしてください。

5.2 脱パラフィン/水和

	スライドの脱パラフィン後は、どの時点でもスライドを乾燥させないようにしてください。すべてのインキュベーションステップで、加湿チャンバーを使用してください。各溶液で組織の全体を確実にカバーしてください。
	2. 切片をキシレン洗浄液で5分間ずつインキュベートしてください。3回繰り返してください。
	3. 切片を100%エタノール洗浄液で10分間ずつインキュベートしてください。2回繰り返してください。
	4. 切片を95%エタノール洗浄液で10分間ずつインキュベートしてください。2回繰り返してください。
	5. 切片をdH₂Oで5分間ずつ洗浄してください。2回繰り返してください。

5.3 抗原賦活化

エピトープを最大限に賦活化するために、自動抗原賦活化装置 (圧力釜) を用いたEDTAによる抗原賦活化を推奨します。このプロトコールでは、Biocare Medical社のDecloaking Chamber (#DC2012) 用の推奨条件を記載しています。他の抗原賦活化装置では、設定や操作方法が異なります。

6.	24枚用スライドホルダーにスライドを入れ、室温の1X EDTA Unmasking Solution 250 mLに浸してください。スライドホルダーがすべて埋まるように、ブランクのスライドを加えてください。

7. 500 mLのdH₂Oを自動抗原賦活化装置 (圧力釜) に入れてください。

8. スライドホルダーがヒートシールドに触れるようにして、自動抗原賦活化装置 (圧力釜) 内に入れてください。スライドコンテナ用の蓋で、部分的にカバーしてください。

ブランクのスライドと、250 mLの水が入った24枚用スライドホルダーも自動抗原賦活化装置 (圧力釜) に入れ、蓋で部分的にカバーすると有利な場合があります。

9. 蓋を閉めて、賦活化を進めてください。Biocare Medical社のDecloaking Chamber (#DC2012) 用の設定は、110°Cで30分間です。

10. 慎重に装置の排気を行い、その後、蓋を外してください。

11. 自動抗原賦活化装置 (圧力釜) からスライド容器を取り出し、実験台上で10分間冷却してください。

12.	スライドのコンテナをdH₂Oの蛇口の下に置き、EDTAがdH₂Oに置換されるまでスライドコンテナに直接水を加えてください。

5.4 イメージングラウンド1：染色

	13. スライドを150 µLのSignalStar Imaging Round 1 Solutionに浸し、室温で40分間インキュベートしてください。
	プロトコールを複数の日に分けて行う場合は、スライドをSignalStar Imaging Round 1 Solutionに浸し、4°Cで一晩インキュベートすることができます。
	14. スライドから液体を完全に振り落とし、1X TBST中に30秒間浸してください。
	15. スライドを10%中性緩衝ホルマリン液に浸し、室温で5分間インキュベートしてください。
	16. スライドから液体を完全に振り落とし、dH₂Oに30秒間浸してください。

5.5 イメージングラウンド1：増幅

17.	Amplification Solutionの1と2を用いて、8ラウンドの増幅を行ってください。セクション8.2に記載しているSignalStarイメージングラウンド1チェックリストを用いて進捗を追跡してください。各増幅ラウンドでは、以下のステップを行ってください：

スライドを150 µLのAmplification Solution 1に浸し、8分間インキュベートしてください。
スライドから液体を完全に振り落とし、dH₂Oに30秒間浸してください。
スライドを150 µLのAmplification Solution 2に浸し、8分間インキュベートしてください。
スライドから液体を完全に振り落とし、dH₂Oに30秒間浸してください。

5.6 イメージングラウンド1：ライゲーション

	18. スライドを150 µLのSignalStar Ligation Bufferに浸し、室温で20分間インキュベートしてください。
	19. スライドから液体を完全に振り落とし、dH₂Oに30秒間浸してください。

5.7 イメージングラウンド1：イメージング

	20. データシートの指示に従って、DAPI #4083溶液を調製してください。
	21. スライドを1X TBST中に30秒間浸してください。
	22. DAPI溶液で対比染色してください。
	23. スライドを1X TBST中に30秒間浸してください。
	24. スライドをProLong Gold Antifade Reagent #9071で封入してください。
	25. 可能な限り速やかにスライドのイメージングを行ってください。最長8時間は強いシグナルが得られます。
	イメージング完了後すぐに、次のラウンドのイメージングが行えるように蛍光シグナルをスライドから取り除くことができます。イメージングラウンド2は、イメージングラウンド1に続いて可能な限り速やかに行ってください。

6 SignalStarイメージングラウンド2：溶液の調製

	各溶液は、調製後すぐに使用してください。溶液の調製前に、SignalStarイメージングラウンド2：セクション7の全プロトコールをお読みください。
	SignalStarイメージングラウンド2は、2つのイメージングラウンドを必要とする抗体パネルの場合のみ実施してください。このページのセクション9.1および8.1に記載しているSignalStarパネルデザインの例とSignalStarパネルデザインワークシートをお役立てください。
	SignalStarキット構成品は、特別な記載がない限り使用直前に室温で解凍し、その後、使用中は氷上で保持してください。

6.1 イメージングラウンド2：SignalStar Fluorescent Removal Solution

キット構成品/試薬	必要な容量
キット構成品/試薬	5スライド (µL)	10スライド (µL)
10X dsDNase Buffer	75	150
dsDNase	7.5	15
Nuclease-free Water #12931	667.5	1,335
総量	750	1,500

6.2 イメージングラウンド2：SignalStar Solution

混合したSignalStar Imaging Round 2 Solutionには、イメージングラウンド2用の相補的オリゴヌクレオチドのみが含まれていなければなりません。このページのセクション9.1および8.1に記載しているSignalStarパネルデザインの例とSignalStarパネルデザインワークシートをお役立てください。

Imaging Round 2 Solutionに、SignalStar標識抗体を加えないでください。

キット構成品	必要な容量
キット構成品	5スライド (µL)	10スライド (µL)
SignalStar Antibody Diluent A	525	1,050
SignalStar Antibody Diluent B	225	450
各イメージングラウンド2：SignalStar Complementary Oligo	7.5	15
総量	最大780	最大1,560

6.3 イメージングラウンド2：SignalStar Amplification Solution 1

キット構成品	必要な容量
キット構成品	5スライド (µL)	10スライド (µL)
SignalStar Amplification Buffer A	3,000	6,000
SignalStar Amplification Buffer B	3,000	6,000
SignalStar Amplification Oligo A-488	60	120
SignalStar Amplification Oligo A-594	60	120
SignalStar Amplification Oligo A-647	60	120
SignalStar Amplification Oligo A-750	60	120
総量	6,240	12,480

6.4 イメージングラウンド2：SignalStar Amplification Solution 2

キット構成品	必要な容量
キット構成品	5スライド (µL)	10スライド (µL)
SignalStar Amplification Buffer A	3,000	6,000
SignalStar Amplification Buffer B	3,000	6,000
SignalStar Amplification Oligo B-488	60	120
SignalStar Amplification Oligo B-594	60	120
SignalStar Amplification Oligo B-647	60	120
SignalStar Amplification Oligo B-750	60	120
総量	6,240	12,480

6.5 イメージングラウンド2：SignalStar Ligation Solution

キット構成品/試薬	必要な容量
キット構成品/試薬	5スライド (µL)	10スライド (µL)
SignalStar Ligation Buffer	375	750
Nuclease-free Water #12931	352.5	705
T4 DNA Ligase (5 U/µL)	15	30
ATP (100 mM)	7.5	15
総量	750	1,500

7 SignalStarイメージングラウンド2：使用プロトコール

	各溶液は、調製後すぐに使用してください。溶液の調製前に、SignalStarイメージングラウンド2：セクション7の全プロトコールをお読みください。
	SignalStarイメージングラウンド2は、2つのイメージングラウンドを必要とする抗体パネルの場合のみ実施してください。このページのセクション9.1および8.1に記載しているSignalStarパネルデザインの例とSignalStarパネルデザインワークシートをお役立てください。

7.1 蛍光シグナルの除去

	1. 画像の取得後に、組織を損傷することなく穏やかにカバースリップを取り外すために、スライドをdH₂O中に≥30分間浸してください。
	2. スライドを150 µLのFluorescence Removal Solutionに浸し、37°Cで2時間インキュベートしてください。
	3. スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。
	4. オプション： ProLong Gold Antifade Reagent #9071 (DAPI #4083を含む) でスライドを封入してスライドのイメージングを行い、蛍光シグナルが残っていないことを確認してください。 dH₂O中にスライドを≥30分間浸し、組織を傷つけないようにカバースリップを穏やかに外してください。スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。

7.2 イメージングラウンド2：染色

	5. スライドを150 µLのSignalStar Imaging Round 2 Solutionに浸し、室温で40分間インキュベートしてください。
	6. スライドから液体を完全に振り落とし、dH₂Oに30秒間浸してください。

7.3 イメージングラウンド2：増幅

7.	Amplification Solutionの1と2を用いて、8ラウンドの増幅を行ってください。セクション8.3に記載しているSignalStarイメージングラウンド2チェックリストを用いて進捗を追跡してください。各増幅ラウンドでは、以下のステップを行ってください：

スライドを150 µLのAmplification Solution 1に浸し、8分間インキュベートしてください。
スライドから液体を完全に振り落とし、dH₂Oに30秒間浸してください。
スライドを150 µLのAmplification Solution 2に浸し、8分間インキュベートしてください。
スライドから液体を完全に振り落とし、dH₂Oに30秒間浸してください。

7.4 イメージングラウンド2：ライゲーション

	8. スライドを150 µLのSignalStar Ligation Bufferに浸し、室温で20分間インキュベートしてください。
	9. スライドから液体を完全に振り落とし、dH₂Oに30秒間浸してください。

7.5 イメージングラウンド2：イメージング

	10. データシートの指示に従って、DAPI #4083溶液を調製してください。
	11. スライドを1X TBST中に30秒間浸してください。
	12. DAPI溶液で対比染色してください。
	13. スライドを1X TBST中に30秒間浸してください。
	14. スライドから液体を完全に振り落とし、dH₂Oに30秒間浸してください。
	15. スライドをProLong Gold Antifade Reagent #9071で封入してください。
	16. 可能な限り速やかにスライドのイメージングを行ってください。最長8時間は強いシグナルが得られます。

8 ユーザーワークシート

8.1 SignalStarパネルデザインワークシート

オリゴ標識抗体	相補的オリゴ	イメージングラウンド	488	594	647	750

(Appendix 9.1のパネルデザインの例をご覧ください。)

8.2 SignalStarイメージングラウンド1チェックリスト

増幅ラウンド	ステップ#	✓	手順
増幅ラウンド1	1	□	Amplification Solution 1中で8分間インキュベートしてください。
	2	□	スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。
	3	□	Amplification Solution 2中で8分間インキュベートしてください。
	4	□	スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。
増幅ラウンド2	5	□	Amplification Solution 1中で8分間インキュベートしてください。
	6	□	スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。
	7	□	Amplification Solution 2中で8分間インキュベートしてください。
	8	□	スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。
増幅ラウンド3	9	□	Amplification Solution 1中で8分間インキュベートしてください。
	10	□	スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。
	11	□	Amplification Solution 2中で8分間インキュベートしてください。
	12	□	スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。
増幅ラウンド4	13	□	Amplification Solution 1中で8分間インキュベートしてください。
	14	□	スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。
	15	□	Amplification Solution 2中で8分間インキュベートしてください。
	16	□	スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。
増幅ラウンド5	17	□	Amplification Solution 1中で8分間インキュベートしてください。
	18	□	スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。
	19	□	Amplification Solution 2中で8分間インキュベートしてください。
	20	□	スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。
増幅ラウンド6	21	□	Amplification Solution 1中で8分間インキュベートしてください。
	22	□	スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。
	23	□	Amplification Solution 2中で8分間インキュベートしてください。
	24	□	スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。
増幅ラウンド7	25	□	Amplification Solution 1中で8分間インキュベートしてください。
	26	□	スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。
	27	□	Amplification Solution 2中で8分間インキュベートしてください。
	28	□	スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。
増幅ラウンド8	29	□	Amplification Solution 1中で8分間インキュベートしてください。
	30	□	スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。
	31	□	Amplification Solution 2中で8分間インキュベートしてください。
	32	□	スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。

8.3 SignalStarイメージングラウンド2チェックリスト

増幅ラウンド	ステップ番号	✓	手順
増幅ラウンド1	1	□	Amplification Solution 1中で8分間インキュベートしてください。
	2	□	スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。
	3	□	Amplification Solution 2中で8分間インキュベートしてください。
	4	□	スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。
増幅ラウンド2	5	□	Amplification Solution 1中で8分間インキュベートしてください。
	6	□	スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。
	7	□	Amplification Solution 2中で8分間インキュベートしてください。
	8	□	スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。
増幅ラウンド3	9	□	Amplification Solution 1中で8分間インキュベートしてください。
	10	□	スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。
	11	□	Amplification Solution 2中で8分間インキュベートしてください。
	12	□	スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。
増幅ラウンド4	13	□	Amplification Solution 1中で8分間インキュベートしてください。
	14	□	スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。
	15	□	Amplification Solution 2中で8分間インキュベートしてください。
	16	□	スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。
増幅ラウンド5	17	□	Amplification Solution 1中で8分間インキュベートしてください。
	18	□	スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。
	19	□	Amplification Solution 2中で8分間インキュベートしてください。
	20	□	スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。
増幅ラウンド6	21	□	Amplification Solution 1中で8分間インキュベートしてください。
	22	□	スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。
	23	□	Amplification Solution 2中で8分間インキュベートしてください。
	24	□	スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。
増幅ラウンド7	25	□	Amplification Solution 1中で8分間インキュベートしてください。
	26	□	スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。
	27	□	Amplification Solution 2中で8分間インキュベートしてください。
	28	□	スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。
増幅ラウンド8	29	□	Amplification Solution 1中で8分間インキュベートしてください。
	30	□	スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。
	31	□	Amplification Solution 2中で8分間インキュベートしてください。
	32	□	スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。

9 Appendix

9.1 SignalStarパネルデザインの例

オリゴ標識抗体	相補的オリゴ	製品ペア＃	イメージングラウンド	488	594	647	750
PD-1 (Intracellular Domain) (D4W2J) Rabbit Monoclonal Antibody (SignalStar™ Conjugate 0008)	相補的オリゴ (CO-0008-488)	17942	1	•
PD-L1 (E1L3N^®) Rabbit Monoclonal Antibody (SignalStar™ Conjugate 0005)	相補的オリゴ (CO-0005-594)	28249	1		•
TIM-3 (D5D5R™) Rabbit Monoclonal Antibody (SignalStar™ Conjugate 0010)	相補的オリゴ (CO-0010-647)	15231	1			•
Ki-67 (8D5) Mouse Monoclonal Antibody (SignalStar™ Conjugate 0014)	相補的オリゴ (CO-0014-750)	56398	1				•
CD8ɑ (D8A8Y) Rabbit Monoclonal Antibody (SignalStar™ Conjugate 0004)	相補的オリゴ (CO-0004-488)	45747	2	•
CD68 (D4B9C) Rabbit Monoclonal Antibody (SignalStar™ Conjugate 0007)	相補的オリゴ (CO-0007-594)	77318	2		•
CD20 (E7B7T) Rabbit Monoclonal Antibody (SignalStar™ Conjugate 0011)	相補的オリゴ (CO-0011-647)	36775	2			•
Pan-Keratin (C11) Mouse Monoclonal Antibody (SignalStar™ Conjugate 0003)	相補的オリゴ (CO-0003-750)	97227	2				•

9.2 トラブルシューティングとよくある質問

SignalStar Multiplex IHCのキット&試薬はどのように検証されていますか？

CSTは、SignalStar Multiplex IHCパネルビルダーでお選びいただける各抗体を厳密に検証しています。また、イメージングの両ラウンドにおいて、タイトレーションや蛍光色素との組み合わせを通じて、抗体の様々な条件を試験しています。試験は、様々な腫瘍や組織を用いて行います。また、従来の発色アッセイでも用いられるこれらの抗体は、この蛍光アッセイの基礎となるため、厳密に試験されています。すべてのマルチプレックス構成や組織を試験することはできません。ご質問がありましたら、カスタマーサポートまでお問い合わせください。

このアッセイは凍結組織で機能しますか？

SignalStar Multiplex IHCのキットと試薬は、凍結組織での使用に対してはまだ検証されていません。

マウス反応性抗体はありますか？

SignalStar Multiplex IHCパネルビルダーの最初のステップで“Mouse”を選択すると、抗マウス抗体のリストが表示されます。

利用可能な抗体のリストに標的が見当たりません。それでも何らかの方法で、パネルに追加することができますか？

SignalStar Multiplex IHCキット&試薬は、リストに含まれない抗体との使用に対してはまだ検証されていません。’現在、SignalStar Multiplex IHCアッセイで、お手持ちの抗体を使用するためのカスタムソリューションを開発中です。

SignalStar mIHCは、非破壊技術です。したがって、SignalStarアッセイ後に、同じ組織で目的の抗体を使用した直接免疫蛍光染色を行うことができます。SignalStar™ Fluorescence Removal Kit #32722を使えば、SignalStar mIHCの後に蛍光オリゴを除去し、そのまま直接免疫蛍光染色を行って可視化できます。

このアッセイに用いる抗体と直接標識を組み合わせることはできますか？

SignalStar Multiplex IHCのキット&試薬は、直接標識済み抗体との併用について検証済みです。SignalStar™ Fluorescence Removal Kit #32722を使えば、SignalStar mIHCの後に蛍光オリゴを除去して、SignalStar mIHCの直後にそのまま免疫蛍光染色を行うことができます。この方法で、強力な細胞表面マーカーに対する多くの直接標識抗体が機能することが分かっています。詳細は、この春のAACRで発表された最新のポスターをご覧ください。さらに、直接免疫蛍光染色イメージングに使用可能な、弊社の直接標識抗体の製品ラインナップもご覧ください。

連続切片のSignalStar染色を発色染色と比較すると、より多くの陽性細胞が観察されます。この過剰な染色が正しいかどうかを、どのように確認すればよいですか？

最適化の過程で、蛍光染色では発色染色よりも高い陽性率 (%) を示す可能性があることが分かりました。’過剰な染色が特異的であることを確認するには、細胞内局在や、他の染色との共局在性が正しいことを確認してください。例えば、すべてのCD8^陽性細胞がCD3^陽性である場合、発色染色と比較して過剰なCD8^陽性細胞は、正しい染色である可能性が高くなります。

染色が完了してからスライドをイメージングするまで、スライドをどのぐらいの時間保存できますか？

イメージングラウンド1は、染色完了後、最長8時間は強いシグナルを示すと考えられます。イメージングラウンド2では、イメージングは染色完了後に可能な限り速やかに行うべきですが、最長8時間は強いシグナルを示すと考えられます。

SignalStar Multiplex IHCのキットと試薬は、使用予定の組織に対して最適化する必要がありますか？

SignalStar Multiplex IHCのキット&試薬は、蛍光色素の組み合わせと抗体の染色順について最適化されています。標的の特性と発現レベルは組織によって異なるため、パネル内の抗体濃度を2倍に増やす、または0.5倍に減らすなどの調整を行うことにより、実験で最適なシグナルを取得できます。

このアッセイに含むべき適切なポジティブコントロールは何ですか？複数のコントロールが必要ですか？

各標的について、発色IHCで陽性であることが示されたあらゆる組織が、ポジティブコントロール組織として機能します。標的ごとにポジティブコントロールが必要であるため、複数のコントロールが必要になる場合もあります。最適な比較を行うために、可能な限り連続切片に近いものを使用してください。

このプロトコールに記載されている方法以外の抗原賦活化を行うことはできますか？

最適な結果を得るためにも、SignalStarのプロトコールから逸脱は推奨できません。しかし、プロトコールに詳述されている抗原賦活化方法を使えない場合は、蛍光シグナルが減少しますが、電子レンジを使用してもよいかもしれません。存在量が少ない標的を検出する場合は、電子レンジの使用は推奨できません。この方法では結果の保証はできません。

電子レンジを使用した抗原賦活化を行うには：

1X EDTA Unmasking Solutionを用意してください：1X EDTA Unmasking Solution 250 mLを調製する場合、SignalStain® EDTA Unmasking Solution (10X) (#14747) 25 mLをdH2O 225 mLで希釈してください。スライドを1X EDTA Unmasking Solutionの入った容器に浸し、沸騰直前の温度まで電子レンジで加熱してください (出力レベル10で約2.5分間)。沸騰直前の温度 (95°-98°C) で15分間加熱してください。ほとんどの一般的な電子レンジでは、これはパワーレベル3で8分間、パワーレベル2で7分間になります。その後、電子レンジから取り出し、スライドのコンテナをdH2Oの蛇口の下に置き、EDTAがdH2Oに置換されるまでスライドコンテナに直接水を加えてください。その後の冷却は必要ありません。

脂肪組織、脳組織、正常腎臓組織など、自家蛍光を多く持つ組織に対して、このアッセイを行いたいと考えています。このアッセイがこれらの組織タイプで機能することを実証するサンプルデータはありますか？

弊社は、最適化の過程で多種多様な腫瘍や組織タイプを活用していますが、すべての組織や発現レベルを考慮することはできません。推奨プロトコールに従えば、このアッセイはFFPE組織 (厚さ4-5 uM) でも機能するはずです。また、このアッセイでは、高い増幅機能により強力かつ特異的なシグナルが得られるため、自家蛍光が非常に高いレベルの組織であっても解析できる可能性があります。

ProLong Gold Antifade Reagent #9071の代わりに、別の封入剤を使用することはできますか？

このプロトコールには、ProLong Antifade封入剤が最適です。社内試験により、SlowFade Antifade Reagentはシグナル強度に悪影響があることが分かっています。

For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.

Cell Signaling Technology and SignalStar are trademarks of Cell Signaling Technology, Inc.
E1L3N is a registered trademark of Cell Signaling Technology, Inc. Cy and CyDye are registered trademarks of GE Healthcare. All other trademarks are the property of their respective owners. Visit our Trademark Information page.
© 2023 Cell Signaling Technology, Inc. All Rights Reserved.

作成日：2023年7月

ご質問がありましたら、いつでもお問い合わせください。