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SimpleChIP® Plus Chromatin IPプロトコール (アガロースビーズ)

次の製品の専用プロトコールです：SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9004

必要な試薬

キットに含まれる試薬：

  1. Glycine Solution (10X) #7005
  2. Buffer A (4X) #7006
  3. Buffer B (4X) #7007
  4. ChIP Buffer (10X) #7008
  5. ChIP Elution Buffer (2X) #7009
  6. 5 M NaCl #7010
  7. 0.5 M EDTA #7011
  8. ChIP-Grade Protein G Agarose Beads #9007 (BSAとソニケーション処理したサケ精子由来のDNAでブロッキング済み)
  9. DNA Binding Buffer #10007
  10. DNA Wash Buffer #10008 (4倍量のエタノールを使用前に加えてください)
  11. DNA Elution Buffer #10009
  12. DNA Spin Columns and Collection Tubes #10010
  13. Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012
  14. RNase A (10 mg/ml) #7013
  15. Micrococcal Nuclease #10011
  16. Proteinase K (20 mg/ml) #10012
  17. SimpleChIP® Human RPL30 Exon 3 Primers 1 #7014
  18. SimpleChIP® Mouse RPL30 Intron 2 Primers 1 #7015
  19. Histone H3 (D2B12) Rabbit Monoclonal Antibody (ChIP Formulated) #4620
  20. Normal Rabbit IgG #2729
  21. DTT (Dithiothreitol) #7016

キットに含まれない試薬：

  1. 1X PBS #9872
  2. Nuclease Free Water #12931
  3. エタノール (96-100%)
  4. ホルムアルデヒド (37%ストック溶液)
  5. SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989
! この ! マークは、免疫沈降を行う回数 (IPプレップ数) に応じて量を変更する重要ステップであることを意味します。免疫沈降1回分は、4 x 10‭6個の組織培養細胞、または25 mgの解離した組織に相当します。
!! この !! マークは、操作を進める前にバッファーを希釈する重要なステップであることを意味します。
SAFE STOP これは、実験操作を中断する必要がある場合に、プロトコールを安全に中断できるポイントを示します。

I. 組織のクロスリンクおよびサンプル調製

組織を採取する際、脂肪や壊死組織などの不要な部分をサンプルから取り除いてください。組織サンプルは、すぐにクロスリンクして使用するか、次に使用するまでドライアイスで凍結させて-80°Cで保存してください。最適なクロマチン収量とChIP結果を得るために、免疫沈降1回につき25 mgの組織を使用してください。クロマチン収量は組織の種類により異なるため、一部の組織では免疫沈降1回につき25 mgを超える量が必要となる場合があります。組織ごとに予測されるクロマチン収量については、Appendix Aを参照してください。クロマチンの断片化および濃度の解析 (セクションIV) 用に、クロマチンサンプルを1本余分に用意してください。必要に応じてクロマチンの断片化の最適化 (Appendix B) 用に、クロマチンサンプルを5本余分に用意してください。

実験開始前の準備：

(!) すべてのバッファーの量は、免疫沈降を行う回数に比例して増やす必要があります。

  • 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012と10X Glycine Solution #7005を取り出し、室温に戻してください。PICが完全に解凍されていることを必ず確認してください。
  • 25 mgの組織に対して、Phosphate Buffered Saline (PBS) 3 mL + 200X PIC 15 µLの混合液を調製して、氷上で保持してください。
  • 25 mgの組織に対して、37%ホルムアルデヒド45 µLを用意し、室温で保持してください。メーカーが示す使用期限内の新しいホルムアルデヒドを使用してください。

A. クロスリンク

  1. 新鮮組織または凍結組織サンプルを計量してください。免疫沈降1回につき、25 mgの組織を使用します (ポジティブおよびネガティブコントロールも含めると、1回の実験で少なくとも75 mgの組織が必要です)。
  2. 組織サンプルを60 mmまたは100 mmのディッシュに置き、清潔な解剖用メスまたは剃刀の刃で細かく切り刻んでください。ディッシュは氷上で保持してください。タンパク質分解を防ぐため、組織をよく冷やす必要があります。
  3. 細かく刻んだ組織を、15 mLコニカルチューブに移してください。
  4. 25 mgの組織に対し、PBS + PICの混合液1 mLを加えてください。
  5. タンパク質をDNAにクロスリンクするため、PBS + PICの混合液1 mLに対し、37%のホルムアルデヒド45 µLを加え、室温で20分間振盪させてください。ホルムアルデヒドの終濃度は1.5%です。
  6. PBS + PICの混合液1 mLに対して10X Glycine 100 µLを加えてクロスリンクを止め、5分間室温で混合してください。
  7. 組織を、卓上遠心分離機を用いて500 x gで5分間、4°Cで遠心してください。
  8. 上清を取り除き、25 mgの組織に対しPBS + PICの混合液1 mLで1回洗浄してください。
  9. 卓上遠心分離機を用いて、500 x gで5分間、4°Cで再度遠心分離してください。
  10. 上清を取り除き、25 mgの組織に対しPBS + PICの混合液1 mLで再懸濁し、氷上で保持してください。Medimachine (B) あるいはDounce Homogenizer (C) を用いて組織を解離させて、シングルセル懸濁液となるように調製してください。(SAFE STOP) 破砕する前のサンプルは、-80°Cで最長3か月間保存できます。

B. Medimachine (BD Biosciences：part #340587) を用いた組織破砕

  1. 1000 µLピペットチップの先を切って穴を広げ、組織の塊が通るようにしてください。
  2. PBS + PICの混合液1 mLで再懸濁した組織サンプルを、50 mm Medicone (part #340592) の上部チャンバーに入れてください 。
  3. メーカーの推奨手順に従い、組織を2分間すり潰してください。
  4. 1 mLのシリンジと18ゲージのブラント注射針を用いて、Mediconeの一番下のチャンバーから細胞懸濁液を集めてください。細胞懸濁液を15 mLコニカルチューブに移し、氷上で保持してください。
  5. 組織全体が処理されて均質な懸濁液になるまで、ステップ2-4を繰り返してください。
  6. さらにすり潰す必要がある場合は、組織サンプルにPBS + PICの混合液を追加してください。組織全体がすり潰されて均質な懸濁液になるまで、ステップ2-5を繰り返してください。
  7. 顕微鏡でシングルセル懸濁液であることを確認してください (オプション)。
  8. 卓上遠心分離機を用いて、細胞を2,000 x gで5分間、4°Cで遠心分離してください。
  9. 上清を取り除き、核の調製とクロマチンの断片化 (セクションIII) に進んでください。

C. Dounce Homogenizerを用いた組織破砕

  1. PBS + PICの混合液で再懸濁した組織を、Dounce Homogenizerに移してください。
  2. 20-25回ストロークで組織を破砕します。顕微鏡でシングルセル懸濁液であることを確認してください (オプション)。
  3. 細胞懸濁液を15 mLコニカルチューブに移し、卓上遠心分離機を用いて2,000 x gで5分間、4°Cで遠心分離してください。
  4. 上清を取り除き、核の調製とクロマチンの断片化 (セクションIII) に進んでください。

II. 培養細胞のクロスリンクおよびサンプル調製

最適なChIPの結果を得るために、各免疫沈降に対し約4 x 106個の細胞を使用してください。ポジティブコントロールとネガティブコントロールを含めると、少なくとも12 x 106個の細胞が必要です。HeLa細胞の場合、免疫沈降1回分は増殖培地20 mLで90%コンフルエントに培養した15 cmディッシュの半分量に相当します。クロマチンサンプルを1本余分に用意し、クロマチンの断片化および濃度の解析に使用してください (セクションIV)。細胞タイプにより特徴が異なるため、実験で培養ディッシュを1枚余分に用意し、血球計算版またはセルカウンターを用いて細胞数を計測することを推奨します。

実験開始前の準備：

(!) すべてのバッファーの量は、使用する15 cmの組織培養ディッシュ (または20 mLの浮遊細胞) の数に比例して増やす必要があります。

  • 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012と10X Glycine Solution #7005を取り出し、室温に戻してください。PICが完全に解凍されていることを必ず確認してください。
  • 15 cmディッシュ1枚 (または浮遊細胞20 mL) につき、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 2 mL + 200X PIC 10 µLの混合液を調製して、氷上で保持してください。
  • 15 cmディッシュ1枚 (または浮遊細胞20 mL) につき、PBS 40 mLを調製し、氷上で保持してください。
  • 15 cmディッシュ1枚 (または20 mLの浮遊細胞) の細胞につき、37%ホルムアルデヒド540 µLを調製し、室温で保持してください。メーカーが示す使用期限内の新しいホルムアルデヒドを使用してください。
  1. タンパク質をDNAにクロスリンクするために、20 mLの培地を入れた15 cm培養ディッシュに対して、37%ホルムアルデヒド540 µLを加えてください。浮遊細胞の場合は、37%ホルムアルデヒド540 µLを20 mLの培地に懸濁した細胞に加えてください (浮遊細胞の固定を最適化するため、細胞密度は0.5 x 106細胞/mL未満に調整してください)。手早くディッシュを傾けて混合し、室温で10分間インキュベートしてください。最終的なホルムアルデヒド濃度は1%です。ホルムアルデヒドを加えると、培地の色が変化する場合があります。
  2. 10X Glycine 2 mLを、培地が20 mL入ったそれぞれの15 cmディッシュに加え、手早く回して混合し、室温で5分間インキュベートしてください。Glycineを加えると、培地の色が変化する場合があります。
  3. 浮遊細胞の場合は、細胞を50 mLコニカルチューブに移し、500 x gで5分間、4°Cで遠心分離し、ペレットを氷冷したPBS 20 mLで2回洗浄してください。上清を取り除き、速やかに核の調製とクロマチンの断片化 (セクションIII) に進んでください。
  4. 接着細胞の場合は、培地を取り除き、細胞を氷冷した1X PBS 20 mLで2回洗浄してください。毎回、培養ディッシュから洗浄液を完全に除去してください。
  5. 氷冷したPBS + PICの混合液2 mLを、各15 cmディッシュに加えてください。細胞を掻き取り、冷たいバッファーに懸濁してください。すべてのディッシュから集めた細胞をコニカルチューブ (15 mL) 1本に集めてください。
  6. 卓上遠心分離機を用いて、細胞を2,000 x gで5分間、4°Cで遠心分離してください。上清を取り除き、核の調製とクロマチンの断片化 (セクションIII) に進んでください。(SAFE STOP) この状態で、サンプルを-80°Cで最長3か月間保存することもできます。

III. 核の調製とクロマチンの断片化

実験開始前の準備：

(!) すべてのバッファーの量は、免疫沈降を行う回数に比例して増やす必要があります。

  • 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012を取り出し、室温に戻してください。使用前に、完全に解凍されていることを必ず確認してください。
  • 1 M DTT (DTT #7016 192.8 mg + dH2O 1.12 mL) を調製してください。DTTの結晶が完全に溶解されていることを必ず確認してください。

    (!!) 重要：一旦溶液にした1 M DTTは、-20°Cで保存してください。

  • 10X ChIP Buffer #7008を取り出して室温に戻し、SDSが完全に溶解していることを必ず確認してください。
  • 免疫沈降1回につき、1X Buffer A 1 mL (4X Buffer A #7006 250 µL + 水750 µL) + 1M DTT 0.5 µL + 200X PIC 5 µLの混合液を調製し、氷上で保持してください。
  • 免疫沈降1回につき、1X Buffer B 1.1 mL (4X Buffer B #7007 275 µL + 水825 µL) + 1M DTT 0.55 µLの混合液を調製し、氷上で保持してください。
  • 免疫沈降1回につき、1X ChIP Buffer 100 µL (10X ChIP Buffer #7008 10 µL + 水90 µL) + 200X PIC 0.5 µLの混合液を調製し、氷上で保持してください。
  1. 免疫沈降1回につき、氷冷した1X Buffer A + DTT + PICの混合液1 mLに細胞を再懸濁してください。氷上で10分間インキュベートしてください。3分ごとに、チューブを転倒混和してください。
  2. 卓上遠心分離機を用いて2,000 x gで5分間、4℃で遠心分離し、細胞核を沈殿させてください。上清を取り除き、免疫沈降1回につき、氷冷した1X Buffer B + DTTの混合液1 mLにペレットを再懸濁してください。再度、遠心分離して上清を取り除き、免疫沈降1回につき、1X Buffer B + DTTの混合液100 µLにペレットを再懸濁してください。1.5 mLの微量遠心分離用チューブに移してください (チューブ1本あたり最大1 mLまで)。
  3. 免疫沈降1回につき、Micrococcal Nuclease #10011 0.5 µLを加え、数回転倒混和してください。頻繁に混和しながら37°Cで20分間インキュベートし、約150-900 bpの長さにDNAを断片化してください。3 - 5分ごとに転倒混和してください。DNAを最適なサイズに断片化するために必要なMicrococcal Nucleaseの量は、各組織および細胞株ごとに条件検討した結果から決定する必要があります (Appendix B参照)。HeLaの細胞核の場合、4 x 106個の細胞につきMicrococcal Nuclease 0.5 µL、マウス肝臓の場合、25 mgの組織につきMicrococcal Nuclease 0.5 µLを処理すると、DNAを適切なサイズに断片化できます。
  4. 免疫沈降1回につき、0.5 M EDTA #7011 10 µLを加えて断片化を停止し、チューブを1-2分間氷上で保持してください。
  5. 16,000 x gで1分間、4°Cで遠心分離して細胞核を沈殿させて、上清を除去してください。
  6. 免疫沈降1回につき、1X ChIP Buffer + PIC混合液100 µLに核ペレットを再懸濁し、氷上で10分間インキュベートしてください。
  7. 1.5 mLの微量遠心分離用チューブにライセート (1本あたり最大500 µL) を入れ、2-3回ソニケートして核膜を破砕してください。ソニケーション処理の合間は、サンプルを30秒間氷上でインキュベートしてください。細胞核を完全に破砕するための最適な条件は、ソニケーション処理の前後に細胞核を光学顕微鏡で観察して決定してください。VirTis Virsonic 100 Ultrasonic Homogenizer/Sonicator (1/8-inch probe) の場合、HeLa細胞の核は設定6で20秒間のソニケーション処理を3セット行うことにより、完全に破砕できます。Dounce Homogenizerで20回ライセートをホモジナイズしても細胞核を破砕できますが、破砕が不完全になる可能性があります。
  8. 微量遠心分離機を用いて、9,400 x gで10分間、4°Cで遠心分離して、ライセートを清澄化してください。
  9. 上清を新しいチューブに移してください。(SAFE STOP) これが、クロスリンクしたクロマチン調製液です。使用するまで-80°Cで保存してください。50 µLのクロマチン調製液を、クロマチンの断片化および濃度の解析 (セクションIV) に使用します。この50 µLのサンプルは、-20°Cで一晩保存できます。

IV. クロマチンの断片化および濃度の解析 (推奨ステップ)

  1. クロマチンサンプル 50 µL (セクションIIIのステップ9) に、Nuclease-free water 100 µL、5 M NaCl #7010 6 µL、およびRNase A #7013 2 µLを加えてください。ボルテックスで混合し、37°Cで30分間インキュベートしてください。
  2. RNase Aで処理した各サンプルに、Proteinase K #10012 2 µLを加えてください。ボルテックスで混合し、65°Cで2時間インキュベートしてください。
  3. セクションVIIを参照して、DNA精製用スピンカラムを用いてサンプルのDNAを精製してください。(SAFE STOP) DNAは、-20°Cで最長6か月間保存できます。
  4. DNA精製後、各サンプル10 µLを、100 bpのDNAマーカーとともに1%アガロースゲルで電気泳動し、DNA断片のサイズを測定してください。DNAは、約150-900 bp (1-5個のヌクレオソーム) のサイズに断片化されているはずです。
  5. DNA濃度を測定するために、精製したDNA 2 µLをNuclease-free Water 98 µLに加えて50倍希釈し、OD260を測定してください。原液のDNA濃度 (µg/mL) は、OD260 x 2,500となります。理想的なDNA濃度は、50-200 µg/mLです。

注意：最適なChIPの結果を得るためには、クロマチンのサイズと濃度を適切にすることが非常に重要です。クロマチンを断片化しすぎると、PCRによる定量の際のシグナルが消失する可能性があります。一方で、クロマチンの断片化が不十分な場合、バックグラウンドシグナルが上昇し解像度が低下する可能性があります。また、免疫沈降に用いるクロマチン量が少なすぎると、PCRによる定量の際のシグナルが低下する原因になります。クロマチンの断片化を最適化するためのプロトコールは、Appendix Bに記載されています。

V. クロマチン免疫沈降

最適なChIPの結果を得るために、免疫沈降1回につき約5-10 µgの断片化されたクロスリンククロマチン (セクションIVに記載) を使用してください。これは、破砕した組織25 mgまたは4 x 106個の組織培養細胞から調製された免疫沈降用サンプル100 µLに相当します。一般的には、抗体を加える前にクロマチンサンプル100 µLを1X ChIP Buffer 400 µLで希釈しますが、免疫沈降1回につきクロマチンサンプルが100 µL以上必要な場合は、クロマチンサンプルを希釈する必要はありません。希釈しない場合も、クロマチンサンプルに直接抗体を加えることでクロマチン複合体の免疫沈降ができます。

実験開始前の準備：

(!) すべてのバッファーの量は、免疫沈降を行う回数に比例して増やす必要があります。

  • 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012を取り出し、室温に戻してください。PICが完全に解凍されていることを必ず確認してください。
  • 10X ChIP Buffer #7008を取り出して室温に戻し、SDSが完全に溶解していることを必ず確認してください。
  • 断片化したクロマチン調製液 (セクションIIIのステップ9) を溶かして、氷上で保持してください。
  • Low salt washの調製：免疫沈降1回につき、1X ChIP Buffer 3 mL (10X ChIP Buffer #7008 300 µL + 水2.7 mL) を調製し、使用するまで室温で保持してください。
  • High salt washの調製：免疫沈降1回につき、1X ChIP Buffer 1 mL (10X ChIP Buffer #7008 100 µL + 水900 µL) + 5 M NaCl #7010 70 µLの混合液を調製してください。使用するまで室温で保持してください。
  1. 1本のチューブに、免疫沈降の予定回数分に十分な量の1X ChIP Buffer + PICの混合液を用意してください。免疫沈降1回につき、1X ChIP Buffer 400 µL (10X ChIP Buffer 40 µL + 水360 µL) + 200X PIC 2 µLの混合液が必要です。免疫沈降のサンプル数を決定する時には、ポジティブコントロールのHistone H3 (D2B12) Rabbit Monoclonal Antiroby #4620、およびネガティブコントロールのNormal Rabbit IgG Antibody #2729のサンプルを数に入れてください。調製した混合液のチューブは、氷上で保持してください。
  2. 調製した1X ChIP Bufferへ、免疫沈降1回につき、断片化およびクロスリンクを行ったクロマチン調製液 100 µL (5-10 µgのクロマチン) に相当する量 (セクションIIIのステップ9) を加えてください。免疫沈降10回分であれば、1X ChIP Buffer 4 mL (10X ChIP Buffer 400 µL + 水3.6 mL) + 200X PIC 20 µL + 断片化したクロマチン調製液1 mLを入れたチューブを1本調製してください。
  3. 希釈したクロマチン10 µLを微量遠心分離用チューブに移してください。これが、2%インプットサンプルです。使用するまで-20°Cで保存してください (セクションVIのステップ1で使用します)。
  4. 免疫沈降ごとに、希釈したクロマチン500 µLを1.5 mLの微量遠心分離用チューブに分注し、免疫沈降用抗体を加えてください。必要な抗体量は、免疫沈降ごとに異なるため、お客様ご自身で決定してください。ポジティブコントロールのHistone H3 (D2B12) Rabbit Monoclonal Antibody #4620については、10 µLを免疫沈降サンプルに加えてください。ネガティブコントロールのNormal Rabbit IgG #2729については、1-2 µL (1-2 µg) を免疫沈降サンプルに加えてください。µµCST抗体を用いる場合は、製品のデータシートまたはウェブページに記載されている推奨希釈率を参照し、適切な比較を行うため、CST抗体の濃度に基づいてネガティブコントロールとなるIgG抗体の量 (µg) を算出してください。免疫沈降サンプルを、ローテーターを用いて4°Cで4時間から一晩インキュベートしてください。

    注意：Cell Signaling Technologyのほとんどの抗体は、免疫沈降1回につき1-2 µgを使用することで適切に機能します。濃度の異なる複数のサンプルがある場合は、ネガティブコントロールとなるNormal Rabbit IgG #2729の濃度を最も高濃度の抗体に合わせて使用することを推奨します。

  5. ChIP-Grade Protein G Agarose Beads #9007を軽くボルテックスし、再懸濁してください。その後、すぐにChIP-Grade Protein G Agarose Beads 30 µLを各免疫沈降反応液に加え、ローテーターを用いて4°Cで2時間インキュベートしてください。

    6. 注意：ChIP-Grade Protein G Agarose Beadsは、ソニケーション処理したサケ精子DNAでブロッキングされているため、ChIP-Seqでは使用できません。

  6. 微量遠心分離機を用いて、3,400 x gで軽く1分間遠心分離してProtein G Agarose Beadsを沈殿させて、上清を除去してください。
  7. ChIP-Grade Protein G Agarose BeadsにLow salt wash 1 mLを加えて洗浄し、ローテーターを用いて4°Cで5分間インキュベートしてください。ステップ6-7をさらに2回繰り返し、Low salt washで合計3回洗浄してください。
  8. High salt wash 1 mLをビーズに加え、ローテーターを用いて4°Cで5分間インキュベートしてください。
  9. 微量遠心分離機を用いて、3,400 x gで軽く1分間遠心分離してProtein G Agarose Beadsを沈殿させて、上清を除去してください。速やかにセクションVIに進んでください。

VI. 抗体/Protein G Agarose Beadsからのクロマチンの溶出および脱クロスリンク

実験開始前の準備：

(!) すべてのバッファーの量は、免疫沈降を行う回数に比例して増やす必要があります。

  • 2X ChIP Elution Buffer #7009を取り出して、37°Cのウォーターバスで温め、SDSが完全に溶解していることを確認してください。
  • ウォーターバスまたはサーモミキサーを65°Cに設定してください。
  • 各免疫沈降サンプルおよび2%インプットサンプル用に、1サンプルにつき1X ChIP Elution Buffer 150 µL (2X ChIP Elution Buffer #7009 75 µL+ 水75 µL) を用意してください。
  1. 1X ChIP Elution Buffer 150 µLを、2%インプットサンプル入りのチューブに加え、ステップ6で使用するまで室温で保持してください。
  2. 1X ChIP Elution Buffer 150 µLを、各免疫沈降サンプルに加えてください。
  3. 穏やかにボルテックス (1,200 rpm) しながら、65°Cで30分間処理し、 抗体/Protein G Agarose Beads複合体からクロマチンを溶出してください。本ステップには、サーモミキサーの使用を推奨します。ローテーターを用いて室温で溶出することもできますが、完全に溶出されない可能性があります。
  4. 微量遠心分離機を用いて、3,400 x gで軽く1分間遠心分離してProtein G Agarose Beadsを沈殿させて、上清を除去してください。
  5. 溶出されたクロマチンを含む上清を、慎重に新しいチューブに移してください。
  6. ステップ1で調製した2%インプットサンプルを含むすべてのチューブに、5 M NaCl 6 µLおよびProteinase K #10012 2 µLを加えて脱クロスリンクして、65°Cで2時間インキュベートしてください。インキュベーションは一晩まで延長できます。
  7. 速やかにセクションVIIに進んでください。(SAFE STOP) この状態で、サンプルは-20°Cで最長4日間保存できます。ただし、沈殿物の形成を防ぐために、DNA Binding Buffer #10007を加える前に (セクションVIIのステップ1)、必ずサンプルを室温に戻してください。

VII. スピンカラムを用いたDNAの精製

実験開始前の準備：

  • (!!) 使用前に、エタノール (96-100%) 24 mLをDNA Wash Buffer #10008に加えてください。このステップは、DNA精製の最初のセッティングの前に1度だけ実施してください。
  • セクションVで得られた各DNAサンプルに対し、DNA Purification collection tube #10010を1本ずつ用意してください。
  1. DNA Binding Buffer #10007 750 µLを各DNAサンプルに加え、軽くボルテックスしてください。
    • 1サンプルにつき、5倍量のDNA Binding Bufferを使用します。
  2. ステップ1のサンプル450 µLをそれぞれ、コレクションチューブにセットした各DNAスピンカラムに移してください。
  3. 18,500 x gで30秒間遠心分離してください。
  4. コレクションチューブから各スピンカラムを取り外し、液体を廃棄してください。各スピンカラムをコレクションチューブに再度セットしてください。
  5. ステップ1の残りのサンプル450 µLを、コレクションチューブにセットした各スピンカラムに移してください。ステップ3-4を繰り返してください。
  6. DNA Wash Buffer #10008 750 µLをコレクションチューブにセットした各スピンカラムに加えてください。
  7. 18,500 x gで30秒間遠心分離してください。
  8. コレクションチューブから各スピンカラムを取り外し、液体を廃棄してください。各スピンカラムをコレクションチューブに再度セットしてください。
  9. 18,500 x gで30秒間遠心分離してください。
  10. コレクションチューブと液体を廃棄してください。スピンカラムは廃棄しないでください。
  11. 各DNAスピンカラムを新しい1.5 mLの微量遠心分離用チューブにセットし、DNA Elution Buffer #10009 50 µLを加えてください。
  12. 微量遠心分離機を用いて、18,500 x gで30秒間遠心分離して、DNAを溶出してください。
  13. 各DNAスピンカラムを取り外し、廃棄してください。得られた溶出液が精製されたDNAです。(SAFE STOP) サンプルは、-20°Cで保存できます。

VIII. PCRによるDNAの定量

推奨事項：

  • コンタミネーションを防ぐため、ピペットチップはフィルター付きのものを使用してください。
  • キットに含まれているコントロールプライマーは、ヒトとマウスのRPL30遺伝子 (#7014と#7015) に特異的であり、通常のPCRまたは定量的リアルタイムPCRのどちらにも使用することができます。他の生物種でChIPを実施する場合は、その種で使用可能な適切なプライマーを設計し、最適なPCR条件を決定してください。
  • 非特異的なPCR産物の増幅を防ぐため、ホットスタート用Taqポリメラーゼの使用を推奨します。
  • プライマーの設定は非常に重要です。以下の条件に近いプライマーを設計してください：
プライマーの長さ： 24塩基
至適Tm値： 60°C
至適GC含有量： 50%
アンプリコンのサイズ： 150-200 bp (通常のPCR)
80-160 bp (定量的リアルタイムPCR)

通常のPCR：

  1. 解析するサンプル数に応じた本数の0.2 mL PCRチューブにサンプル番号を記載してください。2%インプットサンプル、ポジティブコントロールのHistone H3サンプル、ネガティブコントロールのNormal Rabbit IgGサンプル、およびDNAコンタミネーションに対するコントロールとしてDNAなしのチューブも用意してください。
  2. 各チューブにDNAサンプル2 µLを分注してください。
  3. マスターミックスを下記の通りに調製してください。分量不足を防ぐために、実際のチューブ数に2本追加した量を調製してください。各反応用チューブにマスターミックス18 µLを加えてください。
試薬 PCR反応1回の分量 (18 µL)
Nuclease-free H2O 12.5 µL
10X PCR Buffer 2.0 µL
4 mM dNTP Mix 1.0 µL
5 µM RPL30 プライマー 2.0 µL
Taq DNA Polymerase 0.5 µL
  1. PCR反応を以下のプログラムで開始してください：
a. 初期変性 95°C 5分間
b. 変性 95°C 30秒間
c. アニーリング 62°C 30秒間
d. 伸長反応 72°C 30秒間
e. ステップbからdを繰り返し、計34サイクル反応させてください。
f. 最終伸長反応 72°C 5分間
  1. 反応終了後、解析用に各PCR産物10 µLを回収し、100 bp DNAマーカーと共に、2%アガロースゲルまたは10%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行ってください。予想されるPCR産物のサイズは、Human RPL30 #7014では161 bp、Mouse RPL30 #7015では159 bpです。

定量的リアルタイムPCR：

  1. 使用するPCR装置のモデルに対応するPCRチューブあるいはPCRプレートに、適切なサンプル番号を記載してください。PCR反応には、ポジティブコントロールのHistone H3サンプル、ネガティブコントロールのNormal Rabbit IgGサンプル、DNAコンタミネーション確認用のコントロールとしてDNAを含まないチューブ、および標準曲線の作成と増幅効率の決定のため2%インプットクロマチンDNAの段階希釈サンプル (希釈なし、1:5、1:25、1:125) を用意してください。
  2. 各PCRチューブまたはPCRプレートの各ウェルに、DNAサンプル 2 µLを分注してください。
  3. 下記の通り、マスターミックスを調製してください。分量不足を防ぐために、必ず実際のチューブ数に2本追加した量を調製してください。PCRチューブまたは各ウェルにマスターミックス18 µLを加えてください。(SAFE STOP) 必要に応じて、遮光のためアルミホイルでプレートを覆い、4°Cの場合は最長4時間、また-20°Cの場合は一晩、装置が使用できるようになるまで保存してください。
試薬 PCR反応1回の分量 (18 µL)
Nuclease-free H2O 6 µL
5 µM RPL30 プライマー 2 µL
SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989 10 µL
  1. PCR反応を以下のプログラムで開始してください：
a. 初期変性 95°C 3分間
b. 変性 95°C 15秒間
c. アニーリングおよび伸長： 60°C 60秒間
d. ステップbからdを繰り返し、計40サイクル反応させてください。
  1. リアルタイムPCR装置に付属のソフトウェアを使用して、定量結果を解析してください。代替法として、Percent Input法により下記の公式を用いて、免疫沈降の効率を算出することもできます。この方法では、各免疫沈降で回収されたシグナルを、インプットクロマチン総量に対する割合 (%) で算出します。

Percent Input = 2% x 2(C[T] 2% Input Sample - C[T] IP Sample)

C[T] = CT= PCR反応の閾値となるサイクル数

APPENDIX A：予想されるクロマチン収量

組織サンプルからクロスリンククロマチンを調製する場合、組織の種類によってクロマチン収量が大きく異なります。以下の表は、HeLa細胞4 x 106個と比較した、組織25 mgから得られるクロマチンの予測収量の範囲と、プロトコールのセクションIVで決定された予測DNA濃度を示しています。 各組織タイプをMedimachine (BD Biosciences) またはDounce Homogenizerを用いて解離したところ、同程度量のクロマチンが得られましたが、 通常、Medimachineを用いて解離された組織由来のクロマチンは、Dounce Homogenizerを用いて解離された組織由来のクロマチンに比べて免疫沈降効率は高くなります。Medimachine Homogenizerでは、脳組織が十分に解離されたシングルセル懸濁液にならないため、脳組織の解離にはDounce Homogenizerを強く推奨します。 最適なChIP結果を得るには、免疫沈降ごとに5-10 µgの消化したクロスリンククロマチンを使用することを推奨します。そのため、一部の組織では免疫沈降ごとに25 mgを超える組織の採取が必要となる場合があります。

組織/細胞 クロマチンの総収量 予想されるDNA濃度
脾臓 組織25 mgあたり20-30 µg 200-300 µg/mL
肝臓 組織25 mgあたり10-15 µg 100-150 µg/mL
腎臓 組織25 mgあたり8-10 µg 80-100 µg/mL
脳 組織25 mgあたり2-5 µg 20-50 µg/mL
心臓 組織25 mgあたり2-5 µg 20-50 µg/mL
HeLa 細胞4 x 106個あたり10-15 µg 100-150 µg/mL

APPENDIX B：クロマチン断片化の最適化

クロスリンクしたクロマチンDNAを150-900 bpの長さに断片化する場合の最適条件は、断片化に用いる組織量または細胞数に対するMicrococcal Nucleaseの比率に大きく依存します。 以下は、特定の組織または細胞タイプにおける最適断片化条件を決定するためのプロトコールです。

  1. プロトコールのセクションI、II、IIIに従い、125 mgの組織または2 X 107個の細胞 (免疫沈降5回分に相当) を用いて、クロスリンクした細胞核を調製してください。 セクションIIIのステップ2が終了した後に処理を停止し、以下の手順に従って進めてください。
  2. 細胞核調製サンプル100 µLを1.5 mLの微量遠心分離用チューブ5本に分注し、氷上で保持してください。
  3. ストックのMicrococcal Nuclease 3 µLを1X Buffer B + DTTの混合液27 µLに加えてください (酵素を10倍に希釈します)。
  4. ステップ2で用意した5本の各チューブに、希釈したMicrococcal Nuclease 0 µL、2.5 µL、5 µL、7.5 µL、10 µLを加え、チューブを数回転倒混和し、頻繁に撹拌しながら37°Cで20分間インキュベートしてください。
  5. 0.5 M EDTA 10 µLを加えて断片化を停止させて、チューブを氷上で保持してください。
  6. 16,000 x gで1分間、4°Cで遠心分離して細胞核を沈殿させて、上清を除去してください。
  7. 細胞核ペレットを1X ChIP Buffer+ PICの混合液200 µLで再懸濁してください。氷上で10分間インキュベートしてください。
  8. ライセートを数回ソニケートして、核膜を破砕してください。ソニケーション処理の合間に、サンプルを30秒間氷上でインキュベートしてください。細胞核を完全に破砕するための最適な条件は、ソニケーション処理の前後に細胞核を光学顕微鏡で観察して決定してください。VirTis Virsonic 100 Ultrasonic Homogenizer/Sonicator (1/8-inch probe) の場合、HeLa細胞の核は設定6で20秒間のソニケーション処理を3セット行うことにより、完全に破砕できます。Dounce Homogenizerで20回ライセートをホモジナイズしても細胞核を破砕できますが、破砕が不完全になる可能性があります。
  9. 微量遠心分離機を用いて、9,4000 x gで10分間、4°Cで遠心分離して、ライセートを清澄化してください。
  10. ソニケーション処理した各ライセート50 µLを新しい微量遠心分離用チューブに移してください。
  11. 各サンプル50 µLに、Nuclease-free water 100 µL、5 M NaCl 6 µL、RNase A 2 µLを加え、ボルテックスで混合し、37°Cで30分間インキュベートしてください。
  12. RNase Aで処理した各サンプルに、Proteinase K 2 µLを加え、ボルテックスで混合し、65°Cで2時間インキュベートしてください。
  13. 各サンプル20 µLを取り出し、100 bp DNAマーカーとともに1%アガロースゲルで電気泳動し、DNA断片のサイズを確認してください。
  14. 得られたDNAが150-900 bp (1-5個のヌクレオソームに相当) の範囲になる断片化条件を確認してください。この最適化プロトコールを用いて検討した、目的サイズのDNA断片を生じる希釈したMicrococcal Nucleaseの量は、目的サイズのDNA断片を生じる1回分の免疫沈降サンプル (破砕した組織25 mgまたは4 x 106個の培養細胞) に加えられるMicrococcal Nuclease原液の10倍量に相当します。例えば、本プロトコールで希釈したMicrococcal Nuclease 5 µLにより150-900 bpのDNA断片が得られた場合、セクションIIIでクロマチンを断片化する際には免疫沈降1回につき0.5µLのMicrococcal Nuclease原液を加えることになります。
  15. 目的サイズのDNAが得られなかった場合は、サンプル毎にMicrococcal Nuclease量を調整しながら、本最適化プロトコールを繰り返してください。 あるいは、消化時間を変更することで、DNA断片化の程度を増減させる場合があります。

APPENDIX C：トラブルシューティングガイド

問題 考えられる原因 推奨される対処法
1. 断片化されたクロマチンの濃度が低すぎる。 細胞数が不十分、あるいは断片化後の細胞核の破砕が不完全。

クロマチン調整液のDNA濃度が50 µg/mLに近い場合、免疫沈降1回につき少なくとも5 µgとなるようにさらにクロマチンを追加して、プロトコールに従って実験を続けてください。

クロスリンクの前に、カウント用に別に用意したディッシュで細胞数を計測し、正確な細胞数を確認してください。さらに、顕微鏡下でソニケーション前後の細胞核を観察し、核が完全に破砕されているかを確認してください。
2. クロマチンの断片化が不十分で、断片が大きすぎる (900 bpを超える)。

細胞のクロスリンクが過剰。10分間以上クロスリンクを行うと、クロマチンの断片化を阻害する可能性がある。

細胞数が多すぎる、またはMicrococcal Nuclease量が足りない。

ホルムアルデヒド濃度を一定にして、時間経過に伴う変化を確認してください。クロスリンク時間を10分間以下に短縮してください。

クロスリンクの前に、別に用意したプレートの細胞数を計測して正確な細胞数を確認し、Appendix Bを参照してクロマチンの断片化条件を最適化してください。
3. クロマチンが過剰に断片化され、断片が小さすぎる (150 bpのモノヌクレオソーム1個分の断片ばかり検出される)。モノヌクレオソーム1個分のDNAになるまでクロマチンを完全に断片化すると、特に長さが150 bp以上のアンプリコンの場合、PCR定量にてシグナルが減弱する可能性がある。 クロマチンの断片化に加えた細胞数が不十分、またはMicrococcal Nuclease量が多すぎる。 クロスリンクの前に、別に用意したプレートの細胞数を計測して正確な細胞数を確認し、Appendix Bを参照してクロマチンの断片化条件を最適化してください。
4. インプットDNAのPCR反応で産物が得られない、または得られる量が非常に少ない。

PCR反応に使用したDNA量が十分でない、またはPCR条件が最適でない。

PCRの増幅領域が、ヌクレオソームフリー領域に及んでいる。

IPに加えたクロマチンが十分でない、またはクロマチンの断片化が過剰。

PCR反応に、より多くのDNAを使用するか、サイクル数を増加させてください。

クロスリンク後に断片化したクロマチンから精製したDNAを用いて、プライマーセットに対する最適なPCR条件を検討してください。

アンプリコンの長さが150 bp以下になるように、別のプライマーセットを設計してください (セクションVIIIのプライマー設計に関する推奨事項を参照してください)。最適なChIP結果を得るために、免疫沈降1回につきクロマチン5–10 µgを加えてください。上記1と3の対応策も参照してください。
5. ポジティブコントロールであるHistone H3抗体の免疫沈降サンプルとRPL30プライマーを用いたPCR反応で増幅が起こらない。

免疫沈降に加えたクロマチンまたは抗体が十分でない、または免疫沈降のインキュベーション時間が短すぎる。

Protein Gビーズからのクロマチンの溶出が不十分。

各免疫沈降反応にクロマチン5-10 µgと抗体10 µLを加えたことを確認して一晩インキュベートし、Protein Gビーズを加えてさらに2時間インキュベートしてください。

Protein Gビーズからのクロマチンの溶出には65°Cが最適です。頻繁に撹拌して、ビーズを懸濁状態に保ってください。
6. ネガティブコントロールのRabbit IgGの免疫沈降産物と、ポジティブコントロールのHistone H3抗体の免疫沈降産物で、PCRでの増幅が同程度になる。

免疫沈降に使用したクロマチン量が過剰、または十分でない。あるいは、免疫沈降に抗体を加えすぎている。

PCR反応に加えたDNAが多すぎる、またはサイクル数が多すぎる。

各免疫沈降反応に対して加える量は、クロマチン15 µgおよびHistone H3 Antibody 10 µLを上限としてください。Normal Rabbit IgG量を、免疫沈降1回につき1 µLまで減らしてください。

PCR反応に加えるDNAを減らすか、PCRのサイクル数を減らしてください。PCRの線形増幅領域内でPCR産物を解析することが非常に重要です。そうしなければ、増幅前のDNA量の差が正確に測定できません。
7. 実験抗体のIP産物のPCR反応で結果が得られない。

PCR反応に加えたDNA量が十分でない。

免疫沈降に使用した抗体量が十分でない。

免疫沈降では機能しない抗体を使用。

PCR反応に、より多くのDNAを使用するか、サイクル数を増加させてください。

通常は、抗体1-5 µgを1回分の免疫沈降反応液に加えます。しかし、実際に必要な量は抗体によって大きく異なります。免疫沈降反応液に加える抗体の量を増やしてください。

別の抗体を検討してください。

作成日：2011年12月

改訂日：2018年6月