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Simple Westernプロトコール

Jess、Abby、Leoシステム、同様のSimple Western システム用

Simple Western アッセイは、従来の ウェスタンブロットワークフローを自動化し、ゲルの作成、 転写、フィルム露光などの手動ステップをなくしたキャピラリーベースの免疫アッセイです。Simple Western技術により、わずか3 µLのインプット サンプルから 感度、再現性、定量性の高いデータが取得でき、たった3時間で解析結果が得られます。本 プロトコールでは、Simple Westernシステム (Jess、 Abby、 Leo システムを含む) を用いてタンパク質を解析するための重要なステップを紹介します。Cell Signaling Technology (CST) は、 一連の抗体 をSimple Westernアッセイで厳密に検証しました。CST® 抗体を使用する際は、各製品ウェブページまたは データシートに記載されている、 化学発光検出モード検証済みの推奨希釈範囲を参照することが重要です。

A. 溶液および試薬

使用する一次抗体以外の サンプル調製からシグナル検出までに必要なすべての試薬は、Simple Westernの 分離モジュールおよび検出モジュールに含まれています。

  1. お使いの装置、検出モード (化学発光または蛍光) 、標的の分子量に 適合する分離モジュールを 選択してください。

    1. 化学発光用分離モジュール

    2. 蛍光分離モジュール

  2. お使いの一次抗体と検出モードに適合する検出モジュール を選択してください。

    注意：

    • 化学発光用検出モジュールは、 200または600キャピラリーのフォーマットで使用可能であり、Jess、 Abby、Leoに適合します。
    • 蛍光用検出モジュールは200キャピラリーのフォーマットで使用可能であり、 Jessにのみ適合します。
    • Leoの場合は、最適なスループットを得るために、600キャピラリーの検出モジュールを使用してください。

    1. 化学発光用検出モジュール

    2. 蛍光用検出モジュール

B. サンプル調製

  1. 400 mM DTT (透明のチューブ) を調製してください。ピペットチップでホイルを刺し、DI水 (イオン交換水) 40  µLを加え、穏やかに混合してください。
  2. 5X Master Mix (ピンク色のチューブ) を調製してください。10X Sample Buffer 20 µLと調製したDTT20 µLを加えてください。穏やかに混合してください。
  3. RIPAバッファー、またはプロテアーゼ阻害剤 およびホスファターゼ阻害剤を含むその他の適切な溶解バッファーを用いて、細胞を溶解してください。最適なタンパク質濃度はタンパク質の発現レベルによって 異なります。必要に応じて、 0.1X Sample Bufferでライセートを希釈してください。
  4. ライセートと5X Master Mixを4:1の割合で混合してください。ピペットで穏やかに混合し、 チューブを閉じてください。
  5. ボルテックスして混合してください。95 Cで5分間、加熱してください。サンプルをボルテックスして混合し、スピンダウンしてください。
  6. 調製したサンプルは、氷上で保持してください。

C. 抗体の調製

  1. 検出モジュール に付属のAntibody Diluent 2で一次抗体を希釈してください。ヤギ一次抗体を使用する場合は、付属のMilk-Free Antibody Diluentで希釈してください。

    2. 注意：CST一次抗体については、製品ウェブページまたはCSTウェブサイト (cellsignal.jp) のデータシートに記載されている、化学発光検出モードで検証された推奨希釈範囲を必ず参照してください。

  2. 二次抗体は、検出モジュールですぐに使用できます。
  3. 調製した抗体は、氷上で保持してください。
  4. Luminol-SおよびPeroxideを調製してください (該当する場合)。Luminol-S 200 µL とPeroxide 200 µLを微量遠心分離チューブに入れ、ピペットで混合し、 氷上で保持してください。

D. プレートのセットアップ

  1. プレートを準備する際は、 アッセイごとに製品添付文書を参照しながらサンプルプレートに試薬をロードしてください。

    2. 注意：プレートに試薬をローディングする際は、様々な 自動液体分注装置を利用可能です。

  2. サンプルプレートを1,000 x g (約2,500 rpm) で5分間遠心し、 液体がウェル内で完全に下に落ちていることを確認してください。Leoを使用する場合は、 プレフィルド試薬プレートを遠心してください。

E. 機器の操作

  1. Compass for Simple Westernソフトウェア、Simple Western機器のコントロールとデータ解析用 アプリケーションを開いてください。
  2. New Assayをクリックし、アッセイの種類と 解析サイズの範囲を選択するか、Open Assayを選択して、保存したアッセイのメニューから選択してください。
  3. Layoutパネルでサンプルプレートの行を割り当て、 Protocolパネルでアッセイのパラメーターを割り当ててください。Leoを使用する場合は、Sample Layoutの Assay Setupをクリックし、必要なカートリッジとサンプルプレートの 行を指定してください。
  4. サンプルプレート (JessおよびAbby) または プレフィルド試薬プレート (Leo) から蒸発防止シールを取り外してください。
  5. 調製したサンプルプレートおよびキャピラリーカートリッジを 機器にロードしてください。Leoを使用する場合は、 プレフィルド試薬プレートをプレフィルド試薬プレートホルダーにロードしてください。機器のドアを閉めてください。
  6. CompassのStartボタンをクリックしてください。機器は以下を 自動的に実行します。
    1. キャピラリー電気泳動
    2. キャピラリー壁へのタンパク質の固相化
    3. ブロッキング
    4. 一次抗体反応
    5. 二次抗体反応
    6. シグナルの検出および画像/データ収集
  7. キャピラリーカートリッジとプレートは、アッセイが完了したら廃棄してください。

F. データ解析

  • アッセイが完了すると、Compass for Simple Westernは自動的に 電気泳動図、レーンビュー画像、 データの定量的結果を表示します。
  • データに注釈を付け、検量線を作成し、タンパク質発現を 標準化する場合は、ビルトインツールを使用してください。
  • 詳細については、 Compass for Simple Westernユーザーガイド を参照してください。

Simple Western技術および関連するリソースの詳細は こちら ：bio-techne.com/simplewestern

For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.

Simple Western, Jess, Abby, Leo, and Compass for Simple Western are trademarks and/or registered trademarks of ProteinSimple.

作成日：2025年9月

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