磁気分離を利用した免疫沈降プロトコール (ウェスタンブロッティングによる解析)

A. 溶液および試薬

注意：Milli-Qまたは同等の精製水で溶液を調製してください。

1. 20X Phosphate Buffered Saline (PBS) (#9808)：1X PBS 1 Lを調製する場合は、20X PBS 50 mLをdH2O 950 mLに加え、混合してください。
2. 10X Cell Lysis Buffer #9803：1X Cell Lysis Buffer 10 mL調製する場合は、10X Cell Lysis Buffer 1 mLをdH2O 9 mLに加え、混合してください。

   注意：使用直前に1 mM PMSF #8553を加えてください。

3. Protein AまたはProtein Gの磁気ビーズ：マウスIgGのプルダウンにはProtein A #70024を使用します。
4. 3X SDS Sample Buffer：(Blue Loading Buffer Pack #7723) 3X SDS Loading Bufferに1/10量の30X DTTを加え、新しい3X Reducing Loading Bufferを調製してください。
5. 磁気分離ラック：#14654を使用してください。

B. 細胞ライセートの調製

1. 培地を吸引してください。目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
2. 未変性状態で細胞を採取するために、培地を除去し、氷冷した1X PBSで細胞を1回洗浄してください。
3. PBSを除去し、氷冷した1X Cell Lysis Buffer 0.5 mLを各プレート (10 cm) に加え、氷上でプレートを5分間インキュベートしてください。
4. プレートから細胞を掻き取り、微量遠心分離用チューブに移してください。氷上で保持してください。
5. 氷上でサンプルを各5秒間、3回ソニケートしてください。
6. 14,000 x gで10分間、4°Cで遠心分離し、上清を新しいチューブに移してください。上清が細胞ライセートです。必要に応じて、ライセートは-80°Cで保存できます。

C. 免疫沈降

細胞ライセートのプレクリア (推奨ステップ)

Protein AまたはProtein Gの磁気ビーズへの非特異的なタンパク質の吸着を低減させるために、細胞ライセートのプレクリアステップを強く推奨します。試験サンプルとアイソタイプコントロールを用意するのに十分な量のライセートに対してプレクリア処理を実施してください。

1. 磁気ビーズのストックチューブを軽くボルテックスし、再懸濁してください。

   重要：使用直前に、磁気ビーズを前洗浄してください。

2. ビーズスラリー20 µLを新しいチューブに移してください。チューブを磁気分離ラックにセットし、10-15秒間静置してください。

   溶液が澄んだらバッファーを慎重に除去してください。1X Cell Lysis Buffer 500 µLを磁気ビーズペレットに加え、軽くボルテックスしてビーズを洗浄してください。チューブを磁気分離ラックに戻してください。溶液が澄んだらバッファーを除去してください。もう一度、洗浄操作を繰り返してください。

3. 細胞ライセート200 µLをプレクリアした磁気ビーズ20 µLに加えてください。

   重要：ライセートの至適濃度は、標的タンパク質の発現レベルによって異なります。開始濃度は、250 µg/mL - 1.0 mg/mLの範囲を推奨します。

4. ローテーターを用いて、室温で20分間インキュベートしてください。
5. 磁気分離ラックを使用して、ライセートから磁気ビーズを分離してください。プレクリアしたライセートを新しいチューブに移してください。磁気ビーズのペレットは廃棄してください。

免疫沈降

重要：一次抗体の免疫沈降で特異的な結合であることを確認できるように、適切なアイソタイプコントロールの使用を強く推奨します。目的の一次抗体と同じ濃度のアイソタイプコントロールを加えたサンプルを用意し、これらのサンプルを同時に免疫沈降してください。

1. 製品のウェブページまたはデータシートに記載されている推奨希釈率になるように、細胞ライセート200 µLに希釈した一次抗体を加えてください。ローテーターを用いて4°Cで一晩インキュベートし、免疫複合体を形成させてください。
2. 磁気ビーズをプレクリアしてください (細胞ライセートのプレクリアセクション、ステップ1とステップ2を参照してください)。
3. ライセートと抗体 (免疫複合体) を含む溶液を、前洗浄した磁気ビーズペレットを入れたチューブに移してください。
4. ローテーターを用いて、室温で20分間インキュベートしてください。
5. チューブを磁気分離ラック (#14654) にセットし、磁気ビーズを沈殿させてください。溶液が澄むまで1-2分間静置してください。ペレットを1X Cell Lysis Buffer 500 µLで5回洗浄してください。洗浄操作は氷上で行ってください。
6. ペレットを3X SDS Sample Buffer 20-40 µLで再懸濁してください。軽くボルテックスして混合した後、30秒間遠心分離してください。
7. サンプルを95-100°Cで5分間加熱してください。
8. チューブを磁気分離ラック (#14654) にセットし、磁気ビーズを沈殿させてください。溶液が澄むまで1-2分間静置してください。上清を新しいチューブに移してください。上清がサンプルです。
9. サンプル (15-35 µL) をSDS-PAGEゲルにロードしてください。
10. サンプルをウェスタンブロッティングで解析してください。(ウェスタンブロッティングプロトコールを参照してください。)

注意：変性した重鎖による標的のバンドのマスキングや、変性した軽鎖による標的のバンドへの干渉を最小限に抑えるために、以下の二次抗体の使用を推奨します。

標的タンパク質の分子量が約50 kDaの場合：

Mouse Anti-rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) Monoclonal Antibody #45262

Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) Monoclonal Antibody (HRP Conjugate) #93702

Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) Monoclonal Antibody #3678

Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) Monoclonal Antibody (HRP Conjugate) #5127

標的タンパク質の分子量が約25 kDaの場合：

Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) Monoclonal Antibody #3678

Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) Monoclonal Antibody (HRP Conjugate) #5127