免疫組織化学染色プロトコール (凍結切片) - SignalStain® Boost Detection Reagent

A. 溶液および試薬

注意：溶液は、逆浸透脱イオン (RODI) 水、または同等の精製水で調製してください。

1. キシレン
2. エタノール (無水変性、病理学グレード 100%および95%)
3. ヘマトキシリン (#14166)
4. 20x Phosphate Buffered Saline (PBS)：(#9808)、1X PBSを1 L調製する場合、 20X PBS 50 mLをdH₂O 950 mLに加え、混合してください。
5. 固定液：
   1. 10%中性緩衝ホルマリン液
   2. アセトン
   3. メタノール
   4. 3%ホルムアルデヒド：100 mLを調製する場合は、1X PBS 81.25 mLに16%ホルムアルデヒド 18.75 mLを加えてください。
6. 10X Tris Buffered Saline (TBS) 洗浄バッファー：(#12498)、1X TBSを 1 L調製する場合、10X TBS 100 mLをdH₂O 900 mLに加え、混合してください。
7. メタノール/ペルオキシダーゼ：調製する場合は、30% H₂O₂ 10 mLをメタノール90 mLに加えてください。 -20°Cで保存してください。
8. ブロッキング液：1X TBST/5%正常ヤギ血清または1X Animal-Free Blocking Solution
   1. 1X TBST/5% Normal Goat Serum：1×TBST 5 mLにNormal Goat Serum (#5425) 250 µLを加えてください。
   2. 1X Animal-Freeブロッキング液：Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019) 1 mLをdH₂O 4 mLに加えてください。
9. 検出システム：SignalStain^® Boost IHC Detection Reagents (HRP, Mouse #8125、HRP, Rabbit #8114、HRP, Rat #72838、HRP, Goat #63707、AP, Mouse #31926、AP, Rabbit #18653、AP, Rat #15764、AP, Goat #26927)
10. 基質：HRP標識用：SignalStain^® DAB Substrate Kit (#8059)、 SignalStain^® Vivid Purple Peroxidase Substrate Kit (#96632)、SignalStain^® Deep Black Peroxidase Substrate Kit (#72986)、SignalStain^® Radiant Yellow Peroxidase Substrate Kit (#69644)、AP標識用：SignalStain^® Vibrant Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit (#76713)、SignalStain^® Ultra Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit (#12824)
11. 封入剤：SignalStain^® Mounting Medium II (#84583)、 SignalStain^® Aqueous Mounting Medium (#27290)

B. 切片作製

1. -80℃で保存した組織の場合：切片を作製する 前に冷凍庫から取り出し、-20°Cで約15分間平衡化してください。これにより切片作製時のブロックの亀裂を防ぐことができます。
2. ​6-8 µmの範囲で組織を薄切し、正に帯電したスライドに貼り付けてください。
3. 固定する前に切片を数分間実験台で風乾してください (これにより切片のスライドへの接着が促進されます)。

C. 固定

注意：各抗体について、最適な固定剤を決定する必要があります。

スライド上で切片が乾いたことを確認し、下記の手順で最適な固定剤で固定してください。

1. 10%中性緩衝ホルマリン液：室温で10分間。すぐに 染色に進んでください (セクションD)。
2. 冷したアセトン：-20°Cで10分間。空気乾燥。すぐに染色に進んでください (セクションD)。
3. メタノール：-20°Cで10分間。すぐに染色に進んでください (セクションD)。
4. 3% ホルムアルデヒド：室温で15分間。すぐに染色に進んでください (セクションD)。
5. 3%ホルムアルデヒド/メタノール：室温で3%ホルムアルデヒド溶液に15分間浸漬した後、-20°Cの メタノールに5分間浸漬します (その間は洗浄しません)。すぐに染色操作Dに進んでください (セクションD)。

D. 染色

1. 洗浄バッファーで切片を各5分間、2回洗浄してください。
2. メタノール/ペルオキシダーゼ中で、室温で10分間インキュベートしてください。
3. 洗浄バッファーで切片を各5分間、2回洗浄してください。
4. ブロッキング液100-400 µL中、で各切片を室温で1時間ブロッキングしてください。
5. ブロッキング液を除去し、推奨抗体希釈液で希釈した一次抗体 100-400 µLを 各切片に加えてください。
6. 4°Cで一晩インキュベートしてください。
7. SignalStain^® Boost Detection Reagentを室温に戻してください。
8. 抗体溶液を除去し、洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗浄してください
9. 切片を覆うようにSignalStain^® Boost Detection Reagentを滴下 (1-3滴) してください。
10. 加湿チャンバー内で、室温で30分間インキュベートしてください。
11. 洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗浄してください。
12. 製品使用情報に従って、基質を調製してください。
13. スライドに100-400 µLの基質を添加してください。反応を注意深く観察してください。推奨反応時間は使用する 基質によって異なります。詳細については製品使用情報を参照してください。
14. スライドをdH₂Oに浸してください。
15. 必要に応じて、製造元の指示に従い、ヘマトキシリンで切片を対比染色してください。
16. 切片をdH₂Oで各5分間、2回洗浄してください。
17. 切片を脱水してください：
    1. 95%エタノールで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
    2. 100%エタノールで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
    3. キシレンで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
18. 切片をカバーガラスで封入してください。