HRP Chemiluminescent ELISA-P (HRP化学発光ELISA-P)

A. 溶液および試薬

1. 炭酸バッファー：15 mM Na₂CO₃、35 mM NaHCO₃、0.2 g/L NaN₃ (pH 9.6)。1 µMとなるように、合成ペプチドを加えた炭酸バッファーを使用してください。
2. 10X Phosphate Buffered Saline (PBS)：(#9808) 1 Lを調製する場合は、塩化ナトリウム (NaCl) 80 g、塩化カリウム (KCl) 2 g、リン酸水素ナトリウム (Na₂HPO₄) 14.4 g、リン酸カリウム (KH₂PO₄) 2.4 gをdH₂O 1 Lに溶解してください。pHを7.4に調整してください。
3. 洗浄バッファー：1X PBS containing 0.05% Tween-20 (PBST) #9809
4. ブロッキングバッファー：10 mg/mLのウシ血清アルブミン (BSA) #9998含有PBST
5. 一次抗体希釈バッファー：1 mg/mLのBSA含有PBST
6. 二次抗体希釈バッファー：3% BSA含有PBST
7. 96ウェルプレート：化学発光の検出のため、ソリッドホワイトまたは不透明プレートをご使用ください。

B. 96-ウェルプレートへのペプチドの固相化

1. 96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに、1 µMの合成ペプチドを加えた炭酸バッファー溶液100 µLを加え、4°Cで一晩、もしくは37°Cで2-6時間インキュベートし、プレートにペプチドを固相化してください。もしペプチドが結合されない場合には、pH 4-8の範囲の他のバッファーで試してください。
2. 1ウェルあたり200 µLの洗浄バッファーで、プレートを3回洗浄してください。
3. 1ウェルあたり200 µLのブロッキングバッファーを加え、37°Cで1時間インキュベートし、プレートをブロッキングしてください。洗浄バッファーでプレートを3回洗浄してください。(必要に応じて、乾燥したプレートを4°Cで1-2か月間保存することも可能です。)

C. HRP標識一次抗体を使用する場合

1. 一次抗体希釈バッファーを用いて、HRP標識一次抗体を推奨希釈率となるように希釈してください。各ウェルに100 µLを加え、37°Cで1時間インキュベートしてください。
2. 洗浄バッファーで5回洗浄してください。
3. Luminol/Enhancer Solution (#7003) とStable Peroxide Bufferを等量ずつ混合したワーキング溶液を調製してください。
4. プレート用ルミノメーターを用いて、基質を加えてから1-10分以内に、425 nMでの相対発光量 (Relative Light Units : RLU) を測定してください。
5. 10分以内に測定した場合に、至適なシグナル強度が得られます。

D. HRP標識二次抗体を使用する場合

1. 一次抗体を一次抗体希釈バッファーを用いて推奨希釈率となるように調製してください。 各ウェルに100 µLを添加し、4°Cで一晩、または37°Cで2-6時間インキュベートしてください。
2. 洗浄バッファーでプレートを3回洗浄してください。
3. HRPで標識されたAnti-mouse IgG, HRP-linked Antibody #7076を二次抗体希釈バッファーを用いて推奨希釈率となるように調製してください。 各ウェルに100 µLを添加し、37°Cで1時間インキュベートしてください。
4. 洗浄バッファーで5回洗浄してください。
5. Luminol/Enhancer Solution (#7003) とStable Peroxide Bufferを等量ずつ混合したワーキング溶液を調製してください。
6. プレート用ルミノメーターを用いて、基質を加えてから1-10分以内に、425 nMでの相対発光量 (Relative Light Units : RLU) を測定してください。
7. 10分以内に測定した場合に、至適なシグナル強度が得られます。