フローサイトメトリー (FoxP3/転写因子の固定、透過化プロトコール)

A. 溶液および試薬

本プロトコールに必要なすべての試薬は、FoxP3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization Kit #43481に含まれています。下に記載されているカタログ 番号から、個別にご購入いただくこともできます。

1. FoxP3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization Diluent (1X) (#58766)
2. FoxP3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate (4X) (#44931)：FoxP3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization Diluent (1X) で希釈し、必要な量の1X Working Solutionを調製してください。
3. FoxP3/Transcription Factor Permeabilization Buffer (10X) (#68751)：逆浸透脱イオン (RODI) 水、または同等の精製水で希釈し、必要な量の1X Working Solutionを調製してください。 すべての洗浄ステップと 固定後の抗体のインキュベーションに使用します。

注意：蛍光細胞染色色素 (生死判定色素、DNA色素など) を使用する場合は、各色素の製品ページ の推奨プロトコールを確認してください。 フローサイトメトリーでの使用が検証された、細胞染色色素の製品リストをご覧ください。

B. 固定と透過化

注意：接着細胞または組織は、固定の前に十分に解離させてシングルセル懸濁液にしてください。 全血を用いる場合は、 固定の前にRBC Lysis Buffer (#46232) を使用して赤血球を溶解し、遠心分離で洗浄してください。

注意：固定の前に、CDマーカーまたは他の細胞外エピトープを標的とする抗体を加えることができます。 固定プロセスの間、抗体は目的とする標的に結合したままです。 固定の前に洗浄ステップを実施できますが、必須ではありません。

注意：遠心分離の最適条件は、細胞タイプや試薬の容量によって異なります。 一般的には、150-300 gで1-5分間の遠心分離で細胞を十分に沈殿させることができます。

1. 遠心分離で細胞を沈殿させて、上清を除去してください。
2. 「A. 溶液および試薬」に従って調製した、FoxP3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization 1X Working Solution 1 mLに細胞を再懸濁してください。 細胞間でクロスリンクが生じないように、ペレットをよくほぐしてください。
3. 室温 (20-25°C) で30-60分間インキュベートしてください。遮光してください。
4. 過剰量の1X FoxP3/Transcription Factor/Permeabilization Buffer中で遠心分離して洗浄してください。 上清を捨ててください。もう一度、このステップを行ってください。

C. 免疫染色

注意：細胞数を血球計算盤かその他の方法で計測してください。

1. 必要な細胞数をチューブまたはウェルに分注してください。(通常、1アッセイにつき5x10⁵ -1x10⁶細胞が必要です。)
2. 細胞を、1X FoxP3/Transcription Factor/Permeabilization Bufferで推奨希釈率に 希釈した抗体100 µLで再懸濁してください。希釈率は、個々の抗体のデータシートあるいは製品ウェブページに記載の推奨希釈率を参照するか、タイトレーションを行って決定してください。
3. 室温 (20-25°C) で1時間インキュベートしてください。遮光してください。
4. 過剰量の1X FoxP3/Transcription Factor/Permeabilization Buffer中で遠心分離して洗浄してください。 上清を捨ててください。もう一度、このステップを行ってください。
5. 蛍光標識一次抗体を使用している場合は、1X FoxP3/Transcription Factor/Permeabilization Buffer 200-500 µLで細胞を再懸濁し、 フローサイトメーターで解析してください。 未標識一次抗体を使用している場合は、次のステップに進んでください。
6. 細胞を、 1X FoxP3/Transcription Factor/Permeabilization Bufferで推奨通りに希釈した蛍光標識二次抗体で 再懸濁してください。
7. 室温 (20-25°C) で30分間インキュベートしてください。遮光してください。
8. 過剰量の1X FoxP3/Transcription Factor/Permeabilization Buffer中で遠心分離して洗浄してください。 上清を捨ててください。もう一度、このステップを行ってください。
9. 細胞を1X FoxP3/Transcription Factor/Permeabilization Buffer 200-500 µLで再懸濁し、フローサイトメーターで解析してください。

For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.