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フローサイトメトリー (メタノールによる透過化プロトコール)

重要：製品ウェブページに記載の各製品専用フローサイトメトリープロトコールで、適切な固定および透過化の条件、抗体の推奨希釈率を確認してください。

A. 溶液および試薬

本プロトコールに必要なすべての試薬は、Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593に含まれています。下に記載されているカタログ番号から個別にご購入いただくこともできます。

注意：溶液は、逆浸透脱イオン (RODI) 水、または同等の精製水で調製してください。

  1. 1X Phosphate Buffered Saline (PBS)：1X PBSを1 L調製する場合は、10X PBS (#12528) 100 mLを精製水900 mLに加え、混合してください。
  2. 4% Formaldehyde, Methanol-Free (#47746)
  3. 100% Methanol #13604：使用前に氷冷してください。
  4. 抗体希釈バッファー：すぐに使用可能なFlow Cytometry Antibody Dilution Buffer (#13616) を購入するか、0.5 gのBovine Serum Albumin (BSA) (#9998) を100 mLの1X PBSに溶解して0.5% BSA PBSバッファーを調製してください。4°Cで保存してください。
  5. 推奨二次抗体：未標識抗体を検出する際は、使用する一次抗体の宿主種 (例：ラビット) に対応した二次抗体を選択してください。 フローサイトメトリー検証済み二次抗体の最新リストは、こちらからご覧いただけます。
  6. (オプション) FluoroClear Blocking Buffer #33449

注意：蛍光細胞染色色素 (生死判定色素、DNA色素など) を使用する場合は、各色素の製品ページの推奨プロトコールを確認してください。フローサイトメトリーでの使用が検証された、細胞染色色素の製品リストをご覧ください。

B. 固定

注意：接着細胞または組織は、固定の前に十分に解離させてシングルセル懸濁液にしてください。

注意：遠心分離の最適条件は、細胞タイプや試薬の容量によって異なります。一般的には、150-300 gで1-5分間の遠心分離で細胞を十分に沈殿させることができます。

注意：全血を用いる場合は、固定の前に赤血球を溶解し、遠心分離して洗浄してください。

注意：エピトープがホルムアルデヒドやメタノールによって破壊されるときは、固定の前にCDマーカーまたは他の細胞外タンパク質を標的とする抗体を追加してください。この場合、抗体を標的に結合させた状態で固定と透過化プロセスを行います。 ただし、一部の蛍光色素 (PEやAPC) はメタノールで損傷を受けるので、透過化の前に加えないよう注意してください。初めて行う実験については、スモールスケールで予備実験を行うことをお勧めします。

  1. 遠心分離で細胞を沈殿させて、上清を除去してください。
  2. 100万個の細胞につき、約100 µLの4%ホルムアルデヒドで細胞を再懸濁してください。個々の細胞どうしがクロスリンクされないように、ペレットをよくほぐしてください。
  3. 室温 (20-25°C) で15分間固定してください。
  4. 透過化のステップに進んでください。
    1. あるいは、細胞を1X PBS中で一晩保存することもできます。過剰量の1X PBS中で遠心分離して洗浄し、ホルムアルデヒドを除去してください。ホルムアルデヒドを含む上清は適切な廃棄容器に捨ててください。 1X PBSで細胞を再懸濁し、4°Cで保存してください。

C. 透過化処理

  1. 予め冷やしておいた細胞に、氷冷した100%メタノールをゆっくりと加え、穏やかにボルテックスしながら最終濃度が90%メタノール%になるように細胞を透過化してください。あるいは、上に記載したように、遠心分離してホルムアルデヒドまたはPBSを除去し、氷冷した90%メタノール (v/v、1X PBS) で再懸濁してください。
  2. 氷上で10分間以上静置し、透過化してください。
  3. 免疫染色 (セクションD) に進むか、細胞を-20°Cで90%メタノール中に保存してください。

D. 免疫染色

注意：細胞数を血球計算盤かその他の方法で計測してください。

注意：遠心分離の最適条件は、細胞タイプや試薬の容量によって異なります。通常、150-300 gで1-5分間遠心すれば、細胞を沈殿させるのに十分です。抗体希釈バッファーで洗浄すると、PBSを用いた場合と比べて洗浄ステップでの細胞の損失を低減できます。

  1. 必要な細胞数をチューブまたはウェルに分注してください。(通常、アッセイごとに5x105-1x106細胞が必要です。)
  2. 過剰量の1X PBS中で遠心分離して細胞を洗浄し、メタノールを除いてください。 上清は適切な廃棄容器に捨ててください。必要に応じて洗浄を繰り返してください。
  3. オプション：非特異的バックグラウンドを低減するため、標識抗体を添加する前に、細胞懸濁液にFluoroClearブロッキングバッファーを5 µL加えてください。
  4. 細胞を、抗体希釈バッファーで推奨希釈率またはタイトレーションにより決定した希釈率に調整した一次抗体希釈液100 µLに再懸濁してください。
  5. 室温で1時間インキュベートしてください。
  6. 抗体希釈バッファーまたは1X PBSに懸濁した細胞を遠心分離して洗浄してください。上清を捨ててください。もう一度、このステップを行ってください。直接標識抗体を使用した場合は、ステップ9へ進んでください。
  7. 細胞を、100 µLの希釈した蛍光標識二次抗体溶液 (推奨希釈率になるように抗体希釈バッファーで調整済み) で再懸濁してください。
  8. 室温で30分間インキュベートしてください。
  9. 抗体希釈バッファーまたは1X PBSに懸濁した細胞を遠心分離して洗浄してください。上清を捨ててください。もう一度、このステップを行ってください。
  10. 細胞を1X PBS 200-500 µLで再懸濁し、フローサイトメーターで解析してください。

<a href=""/about-us/contact-us">ご質問がありましたら、いつでもお問い合わせください。

製品は研究用です。診断用には使用できません。

作成日：2025年9月