ELISA-Peptide Assayプロトコール (ELISA-P)

A. 溶液および試薬

1. 炭酸バッファー：15 mM Na₂CO₃、35 mM NaHCO₃、0.2 g/L NaN₃ (pH 9.6)。1 µMとなるように合成ペプチドを加えた炭酸バッファーを使用してください。
2. 10X Phosphate Buffered Saline (PBS)：1 Lを調製する場合は、塩化ナトリウム (NaCl) 80 g、塩化カリウム (KCl) 2 g、リン酸水素ナトリウム (Na₂HPO₄) 14.4 g、リン酸カリウム (KH₂PO₄) 2.4 gをdH₂O 1 Lに溶解してください。pHを7.4に調整してください。
3. 洗浄バッファー：0.05% Tween-20含有1X PBS (PBST)
4. ブロッキングバッファー：10 mg/mLウシ血清アルブミン (BSA) を含むPBST
5. 抗体希釈バッファー：3% BSAを含むPBST
6. DELFIA^® Europium-labeled Anti-mouse IgG (マウスの一次抗体用)、またはAnti-rabbit IgG (PerkinElmer Life Sciences #AD0124) (ラビットの一次抗体用)
7. DELFIA^® Enhancement Solution (PerkinElmer Life Sciences #1244-105)

(DELFIA^®はPerkinElmer, Inc.の登録商標です)

B. プロトコール

1. 96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに、1 µMの合成ペプチドを加えた炭酸バッファー溶液100 µLを加え、4°Cで一晩、または37°Cで2-6時間インキュベートしてプレートにペプチドを固相化してください。ペプチドが結合されない場合には、pH 4-8の他のバッファーで試してください。
2. 1ウェルにつき200 µLの洗浄バッファーでプレートを3回洗浄してください。
3. 1ウェルにつき200 µLのブロッキングバッファーを加え1時間、37°Cでインキュベートし、プレートをブロッキングしてください。その後、洗浄バッファーでプレートを3回洗浄してください。 (必要に応じて、乾燥したプレートを4°Cで1-2か月間保存することもできます。)
4. 抗体希釈バッファーで一次抗体を適切に希釈してください。各ウェルに100 µLを加えて37℃で1時間インキュベートしてください。
5. 洗浄バッファーでプレートを3回洗浄してください。
6. DELFIA Europium-labeled Anti-mouse IgGまたはAnti-rabbit IgGが1ウェルあたり67 ngとなるように抗体希釈用バッファーで希釈し、1ウェルにつき100 µL加えてください。室温で30分間、シェーカー上で穏やかに振盪しながらインキュベートしてください。
7. 洗浄バッファーでプレートを3回洗浄してください。
8. 100 µLのEnhancement Solutionを加え、5分間室温でインキュベートしてください。適切な時間分解プレートリーダーで615 nmの蛍光を測定してください。