PathScan® Sandwich ELISAプロトコール (迅速プロトコール)

注意：本プロトコールは、検出抗体とHRP標識二次抗体を順次追加する2ステップ法ではなく、HRPを直接標識した検出抗体を使用するPathScan^®®キット用 (迅速プロトコール) です。

A. 溶液および試薬

注意：溶液は、脱イオンした精製水またはそれと同等のものを用いて調製してください。

1. マイクロウェルストリップ：開封/使用前に、室温に戻してください。未使用のマイクロウェルストリップは、乾燥剤の入った再封可能な元の袋に戻して4°Cで保管してください。
2. 検出抗体：濃縮ストック溶液を得るために、凍結乾燥させた検出抗体 (赤色の塊) をHRP希釈液 (赤色の溶液) 1 mLで溶解してください。穏やかに混合しながら5分間、室温でインキュベートし、完全に溶解してください。ワーキング溶液を調製するために、溶解した検出抗体1 mLをすべて、新しいチューブに入れたHRP希釈液4.5 mLに加えて、穏やかに混合してください。最良の結果を得るために、溶解後の抗体はできる限りすぐに使用してください。溶解後の未使用の検出抗体は、溶解直後に比べるとシグナルが弱くなる可能性はありますが、4°Cで最長4週間保存できます。
3. HRP希釈液：HRP標識検出抗体を溶解および希釈するための赤色の希釈液です。
4. 1X ELISA Wash Buffer：それぞれのキットに含まれているELISA Wash Buffer (20X) を脱イオン水で20倍希釈し、1Xとしてください。
5. 1X Cell Lysis Buffer：10X Cell Lysis Buffer #9803を脱イオン水で希釈し、1Xとしてください。このバッファーは、4°Cで短期間 (1-2週間) 保存できます。推奨：細胞ライセートの調製に使用する際は、プロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤カクテル (Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) #5872、別売り) および1 mM PMSF (PMSF #8553、別売り) を使用直前に追加してください。
6. TMB Substrate #7004：使用前に室温に戻してください。
7. STOP Solution (#7002)：使用前に室温に戻してください。

B. 細胞ライセートの調製

接着細胞の場合

1. 細胞の密度が80-90%コンフルエントに達したら培地を吸引除去してください。目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
2. 培地を除去し、細胞を氷冷した1X PBSで1回洗浄してください。
3. PBSを除去し、各プレート (直径10 cm) に氷冷した1X Cell Lysis Buffer、1 mM PMSFおよびプロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤カクテルの混合液0.5 mLを加え、プレートを氷上で5分間インキュベートしてください。
4. 細胞をプレートから掻き取り、適切なチューブに移してください。氷上で保持してください。
5. ライセートを氷上でソニケート処理してください。
6. 14,000 rpmで10分間、4°Cで遠心分離し、上清を新しいチューブに移してください。上清が細胞ライセートです。アッセイ1回分ずつに分注し、-80°Cで保存してください。

浮遊細胞の場合

1. 生細胞数が0.5-1.0 x 10⁶細胞/mLに達したら、低速遠心分離 (約1200 rpm) で細胞を集め、培地を除去してください。目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
2. 低速遠心分離 (約1200 rpm) により細胞を集め、5–10 mLの氷冷した1X PBSで1回洗浄してください。
3. 増殖培地50 mLから採取した細胞は、1X Cell Lysis Buffer、1 mM PMSFおよびプロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤カクテルの混合液2.0 mLで溶解できます。
4. ライセートを氷上でソニケート処理してください。
5. 14,000 rpmで10分間、4°Cで遠心分離し、上清を新しいチューブに移してください。上清が細胞ライセートです。アッセイ1回分ずつに分注し、-80°Cで保存してください。

C. 操作手順

注意：アッセイを始める前に、すべての試薬類を室温に戻してください。

1. 上記 (セクションA) の試薬をすべて調製してください。
2. サンプルは希釈せずそのまま用いるか、1X Cell Lysis Bufferで適切な濃度に希釈してください。次のステップ (3-4) でサンプルを等量の検出抗体と混合するため、本ステップではサンプルのタンパク質濃度を2Xに調製し、終濃度を1Xとすることにご注意ください。予備実験で適切なライセート濃度を決定することを推奨しますが、開始濃度を選択するための参考情報として、各キットのデータシートに感度曲線を掲載しています。感度曲線は、広範なライセート濃度にわたる一般的な結果を示しています。
3. 各ウェルに、各サンプル50 µLを加えてください。
4. 各ウェルに検出抗体50 µLを加えてください。
5. プレートをシールし、400 rpm (中程度の振盪速度) に設定した振盪装置上で1時間、室温でインキュベートしてください。
6. テープを穏やかに取り除いて、各ウェルを洗浄してください。
1. 廃棄容器に、プレート内の溶液を捨ててください。
2. 各ウェルを1X Wash Buffer 200 µLで4回、洗浄してください。
3. すべての洗浄操作で、各ウェルに残った液をしっかりと除去するために、強くプレートを新しいペーパータオルに叩きつけてください。ただし、常にウェルを乾燥させないようにしてください。
4. 糸くずの出ないティッシュ (キムワイプ) ですべてのウェルの裏側を拭いてください。
7. 各ウェルにTMB Substrate 100 µLを加えてください。プレートをテープでシールし、遮光して振盪装置上で (400 rpm、中程度の振盪速度) インキュベートしてください (室温で15分間、または37°Cで10分間)。
8. 各ウェルにSTOP Solution 100 µLを加えてください。数秒間、穏やかに振盪してください。

注意：陽性反応の最初の色は青色です。STOP Solutionを加えることにより黄色に変わります。

9. 結果の判定および測定を行ってください：
1. 目視による呈色の判定：STOP Solutionを加えてから30分以内に結果を判定してください。
2. 吸光度測定：糸くずの出ないティッシュですべてのウェルの裏側を拭いてください。STOP Solutionを加えてから30分以内に吸光度 (450 nm) を測定してください。