PathScan® Sandwich ELISA Antibody Pairプロトコール (ELISA-Pair)

A. 溶液および試薬

注意：溶液は、逆浸透脱イオン (RODI) 水、または同等の精製水で調製してください。

1. 20X Phosphate Buffered Saline (PBS)： (#9808) 1X PBSを1 L調製する場合は、20X PBS 50 mLをdH₂O 950 mLに加えて混合してください。
2. Wash Buffer：1X PBS/0.05% Tween 20 (20X PBST #9809)
3. Blocking Buffer：1% BSAと0.05% Tween 20を含む1X PBS

4. 1X Cell Lysis Buffer：10X Cell Lysis Buffer (#9803) を使用してください。1X Cell Lysis Buffer 10 mLを調製する場合は、10X Cell Lysis Buffer 1 mLをdH₂O 9 mLに加えて混合してください。調製したバッファーは、4℃で短期間 (1-2週間) 保存できます。

   推奨事項：1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF #8553) は、使用直前に加えてください。

5. ウシ血清アルブミン (BSA)：(#9998)
6. TMB Substrate：(#7004)

7. STOP Solution：(#7002)

   注意：試薬は用時調製してください。

B. 細胞ライセートの調製

接着細胞の場合

1. 細胞の密度が80-90%コンフルエントに達したら培地を吸引除去してください。調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
2. 培地を除去し、細胞を氷冷した1X PBSで1回洗浄してください。
3. PBSを除去し、各プレート (直径10 cm) に氷冷した1X Cell Lysis Buffer + 1 mM PMSF混合液0.5 mLを加え、プレートを氷上で5分間インキュベートしてください。
4. 細胞をプレートから掻き取り、適切なチューブに移してください。氷上で保持してください。
5. ライセートを氷上でソニケートしてください。
6. 14,000 rpmで10分間、4°Cで遠心分離し、上清を新しいチューブに移してください。上清が細胞ライセートです。1回分ずつに分注し、-80℃で保存してください。

浮遊細胞の場合

1. 生細胞数が0.5-1.0 x 10⁶細胞/mLに達したら、低速遠心分離 (約1,200 rpm) で細胞を集め、培地を除去してください。調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
2. 低速遠心分離 (約1,200 rpm) で細胞を集め、5–10 mLの氷冷した1X PBSで1回洗浄してください。
3. 増殖培地50 mLから回収した細胞を、1X Cell Lysis Buffer + 1 mM PMSF混合液2.0 mLで溶解してください。
4. ライセートを氷上でソニケートしてください。
5. 14,000 rpmで10分間、4°Cで遠心分離し、上清を新しいチューブに移してください。上清が細胞ライセートです。1回分ずつに分注し、-80℃で保存してください。

C. 固相化

1. マイクロプレートをdH₂O 200 µLですすぎ、残っている液を捨てます。逆さにしてペーパータオル上に十分な強さで叩きつけて、ウェル内の余分な液を除去してください。
2. 捕捉抗体を1X PBSで1:100に希釈してください。96ウェルプレート1枚につき、捕捉抗体ストック100 µLを1X PBS 9.9 mLに加えてください。十分に混合し、各ウェルに100 µLを加えてください。プレートを密封したのち、4°Cで一晩インキュベートしてください (17-20時間)。
3. 一晩固相化した後に、静かにプレートのカバーを外し、ウェルを洗浄してください：
   1. 廃棄容器にプレートの内容物を捨ててください。
   2. 1ウェルあたり200 µLの洗浄バッファーで4回洗浄してください。各洗浄操作では、各ウェルに残った液を除去するために、十分な強さでプレートを新しいペーパータオルに叩きつけてください。ただし、常にウェルを乾燥させないようにしてください。
   3. 糸くずの出ないティッシュ (キムワイプ) ですべてのウェルの裏側を拭いてください。
4. プレートをブロッキングしてください。各ウェルにブロッキングバッファー150 µLを加え、プレートを密封したのち、37°Cで2時間インキュベートしてください。
5. ブロッキングの後、プレートを洗浄してください (セクションC、ステップ3)。これでプレートはすぐに使える状態です。

D. 操作手順

1. ライセートは、そのまま、もしくはブロッキングバッファーで希釈して使用してください。各ウェルにライセート100 µLを加えてください。プレートを密封して37°Cで2時間インキュベートしてください。
2. プレートを洗浄してください (セクションC、ステップ3)。
3. 検出抗体をブロッキングバッファーで1:100に希釈してください。96ウェルプレート1枚につき、検出抗体ストック100 µLをブロッキングバッファー 9.9 mLに加えてください。十分に混合し、各ウェルに100 µLを加えてください。プレートを密封して37°Cで1時間インキュベートしてください。
4. プレートを洗浄してください (セクションC、ステップ3)。
5. 抗マウスまたは抗ラビットのHRP標識二次抗体 (あるいはHRP標識ストレプトアビジン) をブロッキングバッファーで1:1000に希釈してください。 96ウェルプレート1枚につき、二次抗体ストック10 µLをブロッキングバッファー9.99 mLに加えてください。十分に混合し、各ウェルに100 µLを加えてください。密封して37°Cで30分間インキュベートしてください。
6. プレートを洗浄してください (セクションC、ステップ3)。
7. 各ウェルにTMB substrate 100 µLを加えてください。密封して37°Cで10分間インキュベートしてください。
8. 各ウェルにSTOP solution 100 µLを加えてください。数秒間、穏やかに振盪してください。
9. マイクロプレートリーダーで450 nmの吸光度を測定してください。
   1. 目視による呈色の判定：STOP solutionを加えてから30分以内に結果を判定してください。
   2. 吸光度測定：糸くずの出ないティッシュですべてのウェルの裏側を拭いてください。STOP solutionを加えてから30分以内に吸光度 (450 nm) を測定してください。