PathScan® Sandwich ELISAプロトコール (比色ELISA - 凍結乾燥抗体を含むキット用)

A. 溶液および試薬

注意：溶液は精製水で調製してください。

1. マイクロウェルストリップ：使用前にすべての試薬やプレートを室温に戻してください。
2. 検出抗体：凍結乾燥した緑色の塊または粉末です。高濃度のストック溶液を調製するため、1.0 mLの Detection Antibody Diluent (緑) を加えてください。穏やかに混合しながら5分間、 室温でインキュベートし、完全に溶解してください。標準 溶液を調製するため、溶解した検出抗体1.0 mLを、新しいチューブに入れたDetection Antibody Diluent 10.0 mLに加えて、穏やかに混合してください。未使用の標準溶液は 4°Cで4週間保存できます。
3. HRP標識抗体*​：凍結乾燥された赤色の塊または粉末です。高濃度のストック溶液を調製するため、HRP Diluent (赤) 1.0 mLを加えてください。ときおり 穏やかに混合しながら室温で5分間インキュベートし、完全に溶解してください。標準溶液を調製するために、溶解したHRP標識抗体 1.0 mLを、新しいチューブ中に入れたHRP Diluent 10.0 mLに加えて、穏やかに 混合してください。未使用のワーキング溶液は4°Cで4週間保存できます。
4. Detection Antibody Diluent：検出抗体を溶解および希釈する 緑色の希釈液
5. HRP Diluent：HRP標識抗体を溶解および希釈する赤色の希釈液
6. Sample Diluent：細胞ライセートを希釈する青色の希釈液
7. 1X Wash Buffer：PathScan^® Sandwich ELISA Kitに含まれる20X Wash Bufferを精製水で希釈してください。
8. Cell Lysis Buffer：10X Cell Lysis Buffer #9803を希釈して使用してください。このバッファーは、4℃で短期間 (1-2週間) 保存できます。推奨事項：1 mM Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) を使用直前に加えてください。
9. TMB Substrate #7004
10. STOP Solution #7002

*注意：いくつかのPathScan^® ELISAキットは、HRP標識 抗体の代わりにHRP標識ストレプトアビジンを含む場合があります。

B. 細胞ライセートの調製

接着細胞の場合

1. 細胞の密度が80-90%コンフルエントに達したら培地を吸引除去してください。 調節因子を含む新たな培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
2. 培地を除去し、細胞を氷冷した1X PBSで1回洗浄してください。
3. PBSを除去し、各プレート (直径10 cm) に氷冷した1X Cell Lysis Buffer + 1 mM PMSF混合液0.5 mLを加え、 プレートを氷上で5分間インキュベートしてください。
4. 細胞をプレートから掻き取り、適切なチューブに移してください。氷上で保持してください。
5. ライセートを氷上でソニケートしてください。
6. 14,000 rpmで10分間、4°Cで遠心分離し、上清を新しいチューブに移してください。 上清が細胞ライセートです。アッセイ1回分ずつに分注し、-80℃で保存してください。

浮遊細胞の場合

1. 生細胞数が0.5-1.0 x 10⁶ 細胞/mLに達したら、低速遠心分離 (約1200 rpm) で細胞を集め、培地を除去してください。調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
2. 低速遠心分離 (約1200 rpm) により細胞を集め、5–10 mLの氷冷した1X PBSで1回洗浄してください。
3. 増殖培地50 mLから回収した細胞を、1X Cell Lysis Buffer + 1 mM PMSF混合液2.0 mLで溶解してください。
4. ライセートを氷上でソニケートしてください。
5. 14,000 rpmで10分間、4°Cで遠心分離し、上清を新しいチューブに移してください。 上清が細胞ライセートです。アッセイ1回分ずつに分注し、-80℃で保存してください。

C. 操作手順

1. マイクロウェルストリップを室温に戻した後、必要な数のマイクロウェルを折り取ってください。 マイクロウェルをストリップホルダーにセットしてください。未使用のマイクロウェルは、保存バッグ中に再度密封して速やかに4°C で保存してください。
2. 細胞ライセートは、未希釈、あるいは各PathScan^® Sandwich ELISA Kitに含まれる青色のサンプル希釈液で希釈して使用してください。予備実験で適切なライセート濃度を決定していただくことを推奨しますが、開始濃度を選択するための参考情報として 各キットのデータシートに感度曲線を掲載しています。感度 曲線は、広範なライセート濃度におけるキットごとのアッセイ結果を示しています。
3. 適切なウェルに、未希釈、あるいは希釈した各細胞ライセート100 µLを加えてください。テープで密封し、マイクロウェルの上からきつく 押し付けてください。プレートを2時間、37°Cでインキュベートしてください。あるいは、4°Cで一晩 インキュベートできます。
4. テープを穏やかに取り除いてウェルを洗浄してください：
   1. 廃棄容器にプレートの内容物を捨ててください。
   2. 各ウェルを1X Wash Buffer 200 µLで4回、洗浄してください。
   3. 各洗浄操作では、 ウェルに残った液を除去するために、十分な強さでプレートを新しいペーパータオルに叩きつけてください。ただし、常にウェルを乾燥させないようにしてください。
   4. 糸くずの出ないティッシュ (キムワイプ) ですべてのウェルの裏側を拭いてください。
5. 各ウェルに、溶解した検出抗体 (緑) 100 µLを加えてください (セクションA、ステップ2を参照)。 テープで密封し、プレートを1時間、37°Cでインキュベートしてください。
6. 洗浄操作を繰り返してください (セクションC、ステップ4)。
7. 各ウェルに、溶解したHRP標識二次抗体 (赤) 100 µLを加えてください (セクションA、 ステップ3を参照)。テープで密封し、プレートを30分間、37°Cでインキュベートしてください。
8. 洗浄操作を繰り返してください (セクションC、ステップ4)。
9. TMB Substrate 100 µLを各ウェルに加えてください。テープで密封してプレートを37°Cで10分間インキュベートするか、または25°Cで30 分間インキュベートしてください。
10. STOP Solution 100 µLを各ウェルに加えてください。数秒間、穏やかに振盪してください。

注意：陽性反応の最初の色は青色です。STOP Solutionを加えることにより黄色に変わります。

11. 結果を測定してください。
    1. 目視による呈色の判定：STOP Solutionを加えてから30分以内に結果を判定してください。
    2. 吸光度測定：糸くずの出ないティッシュですべてのウェルの裏側を拭いてください。STOP Solutionを加えてから30分以内に吸光度 (450 nm) を 測定してください。