PathScan® Sandwich ELISAプロトコール (化学発光ELISA - 凍結乾燥抗体を含むキット用)

注意：アッセイのインキュベーション温度については、製品のデータシートを参照してください。化学発光ELISAでは、低容量のマイクロプレートを採用しています。各マイクロウェルに必要なサンプル量と試薬量は50 µLです。

A. 溶液および試薬

注意：溶液は精製水で調製してください。

1. マイクロウェルストリップ：使用前にすべての試薬やプレートを室温に戻してください。
2. 検出抗体：凍結乾燥した緑色の塊または粉末です。濃縮ストック溶液を調製するため、0.5 mLのDetection Antibody Diluent (緑) を加えてください。穏やかに混合しながら室温で5分間インキュベートし、完全に溶解してください。ワーキング溶液を調製するため、溶解した検出抗体0.5 mLを、新しいチューブに入れたDetection Antibody Diluent 5.0 mLに加えて、穏やかに混合してください。未使用のワーキング溶液は4°Cで4週間保存できます。
3. HRP標識抗体*​：凍結乾燥された赤色の塊または粉末です。濃縮ストック溶液を調製するため、HRP Diluent (赤) 0.5 mLを加えてください。穏やかに混合しながら室温で5分間インキュベートし、完全に溶解してください。ワーキング溶液を作成するため、溶解したHRP標識抗体0.5 mLを、新しいチューブに入れたHRP Diluent 5.0 mLに加えて、穏やかに混合してください。未使用のワーキング溶液は4°Cで4週間保存できます。
4. Detection Antibody Diluent：検出抗体を溶解および希釈する緑色の希釈液
5. HRP Diluent：HRP標識抗体を溶解および希釈する赤色の希釈液
6. Sample Diluent：細胞ライセートを希釈する青色の希釈液
7. 1X Wash Buffer：PathScan^® Sandwich ELISA Kitに含まれる20X Wash Bufferを精製水で希釈してください。
8. Cell Lysis Buffer：10X Cell Lysis Buffer #9803を希釈して使用してください。このバッファーは、4℃で短期間 (1-2週間) 保存できます。推奨事項：1 mM Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) を使用直前に加えてください。
9. Luminol/Enhancer SolutionおよびStable Peroxide Buffer

*注意：いくつかのPathScan^® ELISAキットは、HRP標識抗体の代わりにHRP標識ストレプトアビジンを含む場合があります。

B. 細胞ライセートの調製

接着細胞の場合

1. 細胞の密度が80-90%コンフルエントに達したら培地を吸引除去してください。調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
2. 培地を除去し、細胞を氷冷した1X PBSで1回洗浄してください。
3. PBSを除去し、各プレート (直径10 cm) に氷冷した1X Cell Lysis Buffer + 1 mM PMSF混合液0.5 mLを加え、プレートを氷上で5分間インキュベートしてください。
4. 細胞をプレートから掻き取り、適切なチューブに移してください。氷上で保持してください。
5. ライセートを氷上でソニケートしてください。
6. マイクロ遠心機で4°C、14,000 rpmで10分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移してください。上清が細胞ライセートです。アッセイ1回分ずつに分注し、-80℃で保存してください。

浮遊細胞の場合

1. 生細胞数が0.5-1.0 x 10⁶細胞/mLに達したら、低速遠心分離 (約1200 rpm) で細胞を集め、培地を除去してください。調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
2. 低速遠心分離 (約1200 rpm) により細胞を集め、5-10 mLの氷冷した1X PBSで1回洗浄してください。
3. 増殖培地50 mLから回収した細胞を、1X Cell Lysis Buffer + 1 mM PMSF混合液2.0 mLで溶解してください。
4. ライセートを氷上でソニケートしてください。
5. 14,000 rpmで10分間、4°Cで遠心分離し、上清を新しいチューブに移してください。上清が細胞ライセートです。アッセイ1回分ずつに分注し、-80℃で保存してください。

C. 操作手順

1. マイクロウェルストリップを室温に戻した後、必要な数のマイクロウェルを折り取ってください。マイクロウェルをストリップホルダーにセットしてください。未使用のマイクロウェルは、保存バッグ中に再度密封して速やかに4°Cで保存してください。
2. 細胞ライセートは、未希釈、あるいは各PathScan^® Sandwich ELISA Kitに含まれる青色のSample Diluentで希釈して使用してください。予備実験で適切なライセート濃度を決定していただくことを推奨しますが、開始濃度を選択するための参考情報として各キットのデータシートに感度曲線を掲載しています。感度曲線は、広範なライセート濃度におけるキットごとのアッセイ結果を示しています。
3. 適切なウェルに、未希釈、あるいは希釈した各細胞ライセート50 µLを加えてください。テープで密封し、マイクロウェルの上からきつく押し付けてください。プレートを2時間、室温でインキュベートしてください。あるいは、プレートを一晩、4°Cでインキュベートすることも可能です。
4. テープを穏やかに取り除いてウェルを洗浄してください：
   1. 廃棄容器にプレートの内容物を捨ててください。
   2. 各ウェルを1X Wash Buffer 150 µLで4回、洗浄してください。
   3. 各洗浄操作では、各ウェルに残った液を除去するために、十分な強さでプレートを新しいペーパータオルに叩きつけてください。ただし、常にウェルを乾燥させないようにしてください。
   4. 糸くずの出ないティッシュ (キムワイプ) ですべてのウェルの裏側を拭いてください。
5. 各ウェルに、溶解した検出抗体 (緑) 50 µLを加えてください (セクションA、ステップ2を参照)。テープで密封し、プレートを1時間、室温でインキュベートしてください。
6. 洗浄操作を繰り返してください (セクションC、ステップ4)。
7. 各ウェルに、溶解したHRP標識二次抗体 (赤) 50 µLを加えてください (セクションA、ステップ3を参照)。テープで密封し、プレートを室温で30分間インキュベートしてください。
8. 洗浄操作を繰り返してください (セクションC、ステップ4)。
9. Luminol/Enhancer SolutionとStable Peroxide Bufferを等量ずつ混合したワーキング溶液を調製してください。
10. ワーキング溶液50 µLを各ウェルに加えてください。
11. プレート用ルミノメーターを用いて、基質を加えてから1-10分以内に、425 nmでの相対発光量 (Relative Light Units：RLU) を測定してください。10分以内に測定した場合に至適なシグナル強度が得られます。