CUT&Tag (マウス) におけるDrosophila Spike-In Control Kitのプロトコール

!このマークは、実施中のCUT&Tag反応数に応じて量を変更する、 プロトコールの重要なステップであることを意味します。

注意：本プロトコールを開始する前に、Concanavalin A Beadsを活性化し、CUT&Tag Assay Kit #77552プロトコールのセクションIおよびIIに従って細胞または組織 サンプルを調製してください。 その後、セクションIに進んでください。

I. サンプル正規化のためのDrosophila Spike-In Nuclei Controlの追加

実験開始前の準備：

• Drosophila Spike-In Nuclei Controlを室温で解凍してください。
• Drosophila Spike-In Nuclei Controlの凍結および解凍は最小限に抑えてください。凍結融解回数を 4回以下に 抑えるため、より小さな容量に分注してください。この回数を超えると、 Drosophila ゲノムへのマッピング率が低下し、1反応あたりに必要な核Spike-in量が増加する可能性があります。例えば、9回の凍結解凍サイクルでは、 Drosophilaへのマッピング率が約50%低下する可能性があります。
• マウス一次抗体を用いるCUT&Tag反応の場合は、ラビット一次抗体を用いる場合よりもDrosophila Spike-In Nuclei Controlの量を減らすことを推奨します。よくあるCUT&Tagアッセイにおけるマウス抗体の結合力の低さ を考慮することにより、抗体の宿主種とSpike-inの生物種の間のタグ化されたクロマチンの比率を 一定に保ち、 Drosophilaの核から過剰なリード数がカウントされるのを回避できます。

1. セクションIIまたはCUT&Tag Assay Kit #77552プロトコールのAppneixに記載された内容に従って調製した細胞懸濁液を、1反応につき100 µLずつ1.5 mLチューブに分注してください。
2. 1反応 (100,000-250,000個の細胞または 1-2.5 mg の組織を含む) につき、Drosophila Spike-In Nuclei Controlを2 µL加えてください。細胞と核Spike-inのこの比率により、発現量の多い標的の場合は通常、DrosophilaのSpike-in 正規化 リードが全シーケンシングリードの約0.5-10%を占める結果が得られます。

   注意：CUT&TagアッセイにおけるDrosophila Spike-In Nuclei Controlの至適用量は 一定ではなく、 Spike-in正規化リードが全 シーケンシングリードの約0.5-10%となるように、お客様ご自身で最適化する必要があります。100,000個未満の細胞または1 mg未満の組織を使用する場合は、 Drosophila Spike-In Nuclei Controlの容量を比例的に減らし、100,000細胞あたりまたは1 mgの 組織 あたり2 µLの比率を維持してください (例：50,000個の細胞に対しては1 µLのDrosophila Spike-In Nuclei Control、25,000個の細胞に対しては0.5 µLのDrosophila Spike-In Nuclei Control )。さらに、標的分子が低発現 (例：特定の転写 因子またはコファクター) の場合は、核Spike-inの量をより減らす必要があるかもしれません。

3. 穏やかにピペッティングで上下させて混合してください。
4. 速やかにセクションIIに進んでください。

II. Concanavalin Aビーズと一次抗体の結合

注意：このセクションの全インキュベーションステップにおいて、振盪 または回転によりサンプルを混合する必要はありません。チューブを指定の温度でラック上に静置するだけで構いません。インキュベーションステップ中にサンプル を混合しても、アッセイの性能は向上しません。検体を回転または 振盪させると、ビーズがチューブ の壁やキャップに付着し、ビーズの凝集や損失につながる可能性があります。

実験開始前の準備：

! すべてのバッファーの量は、実施する CUT&Tag反応数に応じて比例的に増加させる必要があります。

• Digitonin Solution #16359を90-100°Cで5分間温め、完全に 解凍されて溶解していることを確認してください。解凍したDigitonin Solution #16359はすぐに氷上に置き、使用中は氷上で保持してください。その日の作業が終了したら-20°Cで保管してください。
• 使用前にProtease Inhibitor Cocktail (200X) #7012および100X Spermidine #27287を完全に解凍し、その日の作業が終了したら-20°Cで保管してください。 Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012はDMSO含有のため、 氷上に置くと再凍結することに注意してください。
• 1反応につきComplete Antibody Binding Buffer 100 µLを調製し、氷上に置いてください。

1. セクションIのステップ7で調製済みの活性化したConcanavalin Aビーズを、CUT&Tag Assay Kit #77552のプロトコールに従い室温まで戻し、ピペッティングで穏やかに 上下させて十分混合してください。
2. セクションIのステップ3で調製した細胞+Drosophila Spike-In Nucleiの各チューブに、10 µLのビーズ懸濁液 を加えてください。
3. ピペッティングで上下させてサンプルを十分に混合してください。サンプルを室温で5分間インキュベートしてください。
4. チューブを磁気ラックに30秒間から2分間置き、その後上清を除去して廃棄してください。
5. チューブを磁気ラックから外してください。1反応につき100 µLのComplete Antibody Bindingバッファーを加えて、ピペッティングで 穏やかに上下にさせて穏やかに混合し、氷上に置いてください。
6. 各反応チューブに適量の試験抗体と1 µLのH2Av Mouse Monoclonal Antibodyを加えて、 ピペッティングで上下させて穏やかに混合してください。

   注意：CUT&Tag反応に必要な抗体の量は異なるので、 お客様自身で決定してください。ポジティブコントロールとしてTri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit Monoclonal Antibody #9751、またはネガティブコントロールとしてNormal Rabbit IgG #2729もしくはNormal Mouse IgG #68860を使用する場合は、1反応に対し抗体を2 µL 加えてください。可能な限り、CUT&Tag検証済み抗体を アッセイに使用することを強く推奨します。CSTは、厳選したCUT&Tag検証済み 抗体を、根拠となるデータと適切な 希釈比率と共に提供しています。

7. 1時間、室温でインキュベートしてください。このステップは4°Cで一晩まで延長できます。
8. CUT&Tag Assay Kit #77552のセクションIV-VIIに従い、CUT&Tagの実験を続けてください。

III. サンプル正規化のための次世代シーケンシング (NGS) 解析

サンプルを正規化する際は、全サンプルからのCUT&Tagシーケンシングデータを、試験用ゲノム (例えば、ヒト、 マウス、その他) およびDrosophila melanogaster ゲノムの両方にマッピングしてください。各サンプルについて、ユニークスパイクインリード数と 全 ユニークリード数との比率を算出してください。比率が最も低いサンプル (例：下表 のサンプル4) をリファレンスサンプルとして選択し、得られた 式を用いてその他のサンプルの正規化係数を算出してください。これらの係数をバイオインフォマティクス解析に適用するには、bigWigファイルをスケーリングするか (例： deepToolsのbamCoverageを使用)、または各サンプルについて試験ゲノムにアラインメントされたユニークリード数のダウンサンプリングしてください。 シーケンシング深度がサンプル間で一貫している場合、正規化係数はSpike-inリード数と全リード数の比ではなく、 Spike-inリードの絶対数を用いて算出することもできます。

薬物処理 実験におけるマウスH3K27me3抗体を用いたNGSアッセイサンプルの正規化の例 (図1を参照してください)

NGSの正規化係数 = リファレンスサンプルにおけるユニークSpike-inリード数と全ユニークアラインドリード数との比率 / その他のサンプルにおけるユニークSpike-inリード数と全ユニークリード数との比率 。

参考：トラブルシューティングガイド

For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.

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