CUT&Tagキットプロトコール

CUT&Tagプロトコール

! この!マークは、実施するCUT&Tag反応数に応じて量を変更する必要がある、 プロトコールの重要なステップであることを意味します。

!! この!!マークは、操作を進める前にバッファーを 希釈する重要なステップであることを意味します。

SAFE STOP これは、実験操作を中断する必要がある場合に、 プロトコールを安全に中断できるポイントを示します。

I. Concanavalin Aビーズの活性化

実験開始前の準備：

! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&Tag反応数に応じて比例的に増加させる必要があります。

• Concanavalin A Bead Activation Bufferを氷上で保持してください。
• 実行するCUT&Tag反応数を決定してください。ポジティブコントロール として、Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit Monoclonal Antibody #9751 の反応を含めることを強く推奨します。ネガティブコントロール (Normal Rabbit IgG #2729またはNormal Mouse IgG #68860) の使用は任意ですが、ピーク検出アルゴリズムの要件に基づいて 判断してください。

1. Concanavalin A磁気ビーズを、チューブからこぼれないように慎重にピペッティングで上 下させて、均一な懸濁液 (粘り気あり) になるまで再懸濁してください。

   注意：ボルテックスを繰り返すとConcanavalin Aがビーズから外れてしまう場合があります。Concanavalin A磁気ビーズは、 プロトコールのいずれの時点でもボルテックスしないでください。

2. CUT&Tag 1反応につきビーズ懸濁液10 µLを、新しい1.5 mLチューブに移してください。 CUT&Tag反応を一度に14反応以上行う場合は、2本以上の微量遠心分離機用 1.5 mLチューブを使用してください。各1.5 mLチューブに140 µL以上のConcanavalin Aビーズを入れないでください。
3. ビーズ10 µLにつき、Concanavalin A Bead Activation Buffer 100 µLを加えてください。ピペッティングで穏やかに上 下させてビーズを混合してください。
4. チューブを磁気ラックに置き (30秒間から2分間)、その後にピペットを用いて上清を廃棄してください。

   注意：ビーズの損失を避けるため、プロトコールのいずれの時点においても真空吸引はしないでください。

5. チューブを磁気ラックから外してください。ステップ4、5を繰り返して、2回目のビーズの洗浄を実施してください。
6. ビーズ懸濁液の最初の量と同量 (1反応あたり10 µL) のConcanavalin A Bead Activation Bufferを加えて、ピペッティングで上下させて再懸濁してください。

   注意：活性化させたビーズは氷上で最長8時間保管できます。

II. 細胞と組織のサンプル調製

ほぼ全ての細胞タイプにおいて、CUT&Tagアッセイに生細胞を用いることにより、ヒストンや 転写因子、コファクターを安定して濃縮できます。可能な限り生細胞を用いることを強く推奨します。Concanavalin Aにより損傷を受ける、または感受性のある 細胞の場合は、CUT&Tag実験前に細胞を軽く固定するプロトコール ( Appendix A) を参照してください。細胞の固定は、CUT&Tagシグナルを増加させるわけではなく、過剰な固定は タグメンテーション反応にとって有害であることに注意してください。

また、新鮮組織もCUT&Tagアッセイに用いることができ、ヒストンを安定して濃縮できます。ただし、 組織内の転写因子やコファクターなどのヒストン以外の標的は、CUT&Tagアッセイでは十分に濃縮されません。組織内の 転写因子やコファクターの解析には、CUT&RUNアッセイキット #86652の使用を推奨します。通常、新鮮組織では、固定組織と同等またはより 強力なCUT&Tagシグナルが取得できます。固定が必要な場合は、 CUT&Tag実験の前に、Appendix Bの軽い組織固定用のプロトコールを参照してください。

弊社のCUT&Tagアッセイは、様々な細胞や組織サンプルを解析できます。また、幅広いサンプル 量でアッセイを開始できます。1反応あたり100,000個の細胞または1 mgの組織を使用することを推奨します。アッセイ開始時のサンプル量が限られる場合、標的がヒストン修飾であれば1反応あたりわずか 5,000-10,000個の細胞、転写因子 やコファクターであればわずか20,000個の細胞で解析可能かもしれません。少ないインプットでの反応の成否は、 標的の存在量と抗体の感度に依存します。特に転写因子やコファクターの場合、目的の CUT&Tagシグナルを得るにはアッセイ開始時のサンプル量が十分であることが不可欠です。1反応あたり、最大250,000個の細胞または5 mgの組織まで 使用できます。指定された範囲内 (5,000-250,000細胞または1-5 mg の組織) であれば、全プロトコールにわたる1反応あたりのバッファーの量を、細胞数や組織の 重量に応じて調節する必要はありません。指示がある場合は、実施する 反応の数に応じて、比例的にバッファーの量を増やす必要があります。

A. 生細胞サンプルの調製

実験開始前の準備：

! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&Tag反応数に応じて比例的に増加させる必要があります。

• 使用前にProtease Inhibitor Cocktail (200X) #7012および100X Spermidine #27287を完全に解凍し、その日の作業が終了したら-20°Cで保管してください。 Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012はDMSO含有のため、 氷上に置くと再凍結することに注意してください。
• Complete Wash Buffer (1細胞調製サンプルにつき2 mL、さらにCUT&Tag 1反応につき100 µLが必要) を調製し、室温で保持してください。例えば、未処理および薬剤処理した細胞の両方 (2 サンプルの細胞調製) と、4種類の抗体 (ポジティブコントロールのH3K4me3 #9751、ネガティブコントロールのIgG #2729または#68860、および2種類の実験用抗体) を用いた8反応で試験する場合は、合計4.8 mLのComplete Wash Bufferが必要です。

注意：生細胞の調製ステップは全て、細胞へのストレスを最小限にするために、室 温で連続して実施してください。DNAの断片化や 気泡の混入を防ぐために、細胞サンプルのボルテックスは避けてください。

1. 細胞のストレスを最小限にするために、1反応につき100,000個の生細胞を室温で用意してください。

   注意：接着細胞を回収する場合は、トリプシン処理で細胞を培養ディッシュから剥離させた後、 3倍量以上の組織培養液で反応を停止してください。細胞の溶解を防ぐため、 培養ディッシュから細胞を掻き取ることをCSTは推奨しません。正確な数の細胞を実験に用いるため、 血球計算盤や細胞カウンターで細胞数を正確にカウントしてください。

2. 細胞懸濁液を600 x gで3分間、室温で遠心分離し、上清を 除去して廃棄してください。

   注意：総細胞数が100,000個未満で、遠心分離した細胞ペレットが 肉眼で確認できない場合は、以下の洗浄ステップ3-5をスキップしてステップ6に直接進むことを推奨します。ステップ2の 細胞懸濁液の初めの遠心分離後に、上清の大部分を除去して廃棄し、 1反応につき≤40 µLの上清を残すようにします。続くステップ6で、十分量のComplete Wash Bufferを加え、 細胞懸濁液の総量を1反応につき100 µLにしてください。

3. 室温のComplete Wash Buffer 1 mLを加えて、ピペッティングで穏やかに上 下させて細胞ペレットを再懸濁してください。
4. 600 x gで3分間、室温で遠心分離し、上清を除去して廃棄してください。
5. ステップ3と4を繰り返して、もう1度細胞ペレットを洗浄してください。
6. 1反応につきComplete Wash Buffer 100 µLを加えて、ピペッティングで穏やかに上 下させて細胞ペレットを再懸濁してください。
7. 速やかにセクションIIIに進んでください。

B. 組織のサンプル調製

実験開始前の準備：

! すべてのバッファーの量は、実施する CUT&Tag反応数に応じて比例的に増加させる必要があります。

• 使用前にProtease Inhibitor Cocktail (200X) #7012および100X Spermidine #27287を完全に解凍し、その日の作業が終了したら-20°Cで保管してください。 Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012はDMSO含有のため、 氷上に置くと再凍結することに注意してください。
• Complete Wash Buffer (組織調製1サンプルあたり3 mL、さらに1反応につき100 µLが必要) を調製し、細胞のストレスを最小限にするために 室温で保持してください。例えば、野生型および遺伝子組換え型の肝組織を 開始材料として使用する場合 (2種類の組織)、4種類の抗体 (ポジティブコントロール H3K4me3 #9751、ネガティブコントロール IgG #2729または#68860、および2種類の実験用抗体、8反応)、合計6.8 mLの Complete Wash Bufferが必要となります。

1. 新鮮組織を、1反応につき1 mg測り取ります。
2. 組織サンプルをシャーレに置き、清潔な解剖用メスまたは剃刀の刃で細かく切り刻んでください。ディッシュは氷上で保持してください。タンパク質分解を防ぐため、 組織をよく冷やす必要があります。
3. 組織をComplete Wash Buffer 1 mLで再懸濁し、サンプルをDounce Homogenizerに移してください。
4. 組織片を、シングルセル懸濁液になるまで破砕してください。20-25ストロークで、 組織の塊が見られなくなるまで破砕してください。
5. 細胞懸濁液を1.5 mLチューブに移し、3,000 x gで3分間、室温で遠心分離して、 ピペットで細胞から上清を除去して廃棄してください。
6. Complete Wash Buffer 1 mLで細胞ペレットを再懸濁してください。
7. 細胞懸濁液を3,000 x gで3分間、室温で遠心分離し、上清を 除去して廃棄してください。
8. ステップ6-7を繰り返して、もう1度細胞ペレットを洗浄してください。
9. 1反応につきComplete Wash Buffer 100 µLを加えて、ピペッティングで穏やかに上 下させて細胞ペレットを再懸濁してください。
10. 速やかにセクションIIIに進んでください。

III. Concanavalin Aビーズと一次抗体の結合

実験開始前の準備：

! すべてのバッファーの量は、実施する CUT&Tag反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。

• Digitonin Solution #16359を90-100°Cで5分間温め、完全に 解凍されて溶解していることを確認してください。解凍したDigitonin Solution #16359はすぐに氷上に置き、使用中は氷上で保持してください。その日の作業が終了したら-20°Cで保管してください。
• 使用前にProtease Inhibitor Cocktail (200X) #7012および100X Spermidine #27287を完全に解凍し、その日の作業が終了したら-20°Cで保管してください。 Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012はDMSO含有のため、 氷上に置くと再凍結することに注意してください。
• 1反応につきComplete Antibody Binding Buffer 100 µLを調製し、氷上に置いてください。

注意：細胞の透過化に用いるジギトニンの推奨量は過剰量であり、 ほぼ全ての細胞株や組織を十分に透過化できます。ただし、すべての細胞株や組織が、 ジギトニンに対して同じ感受性を示す訳ではありません。特定の細胞株や組織で 推奨濃度のジギトニンが機能しない場合、Appendix Cのプロトコールに従って条件を最適化してください。ジギトニン処理により、細胞集団の90%以上が透過化されている必要があります。

注意：セクションIII-Vのすべてのインキュベーションステップにおいて、 振盪または回転によってサンプルを混合する必要はありません。代わりに、指定の温度でチューブラック上に静置することを推奨します。 インキュベーションステップ中にサンプルを混合しても、アッセイの性能は向上しません。代わりに、サンプルを 回転または振盪すると、チューブ壁や キャップへの付着により、ビーズの凝集やビーズの損失が増加する可能性があります。

注意：Drosophila Spike-In Control Kit for CUT&Tag (Rabbit) #29811 または Drosophila Spike-In Control Kit for CUT&Tag (Mouse) #19629を用いてサンプルの正規化を行う場合は、このCUT&Tag プロトコールのセクションIIIをスキップし、Spike-inコントロールキットのセクションIおよびIIに従ってください。その後、この CUT&TagプロトコールのセクションIVに進んでください。

1. セクションIのステップ7で調製済みの活性化したConcanavalin Aビーズを室温に戻し、ピペッティングで穏やかに上下させて十分 攪拌してください。
2. セクションII-Aのステップ6またはセクションII-Bのステップ9で調製した細胞に、1反応につきビーズ懸濁液を10 µL加えてください。
3. ピペッティングで上下させてサンプルを十分に混合してください。サンプルを室温で5分間インキュベートしてください。
4. チューブを磁気ラックに30秒間から2分間置き、その後上清を除去して廃棄してください。
5. チューブを磁気ラックから外してください。1反応につき100 µLのComplete Antibody Binding Bufferを加えて、 ピペッティングで穏やかに混合してください。
6. 1反応につき細胞とビーズの懸濁液100 µLを、別々の1.5 mLチューブに分注して氷上で保持してください。
7. 各チューブに適量の一次抗体を加えて、ピペッティングで上下させて穏やかに混合してください。

   注意：CUT&Tag反応に必要な抗体の量は異なるのため、 お客様自身で決定してください。ポジティブコントロールとしてTri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit Monoclonal Antibody #9751、またはネガティブコントロールとしてNormal Rabbit IgG #2729もしくはNormal Mouse IgG #68860を使用する場合、1反応につき抗体を2 µL 加えてください。可能であれば、アッセイにCUT&Tag検証済み 抗体を 使用することを強く推奨します。CSTは、厳選されたCUT&Tag検証済み 抗体を、裏付けデータと適切な 希釈比率と共に提供しています。

8. 1時間、室温でインキュベートしてください。このステップは4°Cで一晩まで延長できます。
9. 速やかにセクションIVに進んでください。

IV. 二次抗体の結合

実験開始前の準備：

! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&Tag反応数に応じて比例的に増加させる必要があります。

• Digitonin Solution #16359を90-100°Cで5分間温め、完全に 解凍されて溶解していることを確認してください。解凍したDigitonin Solution #16359はすぐに氷上に置き、使用中は氷上で保持してください。その日の作業が終了したら-20°Cで保管してください。
• 使用前にProtease Inhibitor Cocktail (200X) #7012および100X Spermidine #27287を完全に解凍し、その日の作業が終了したら-20°Cで保管してください。 Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012はDMSO含有のため、 氷上に置くと再凍結することに注意してください。
• 1反応につき1.05 mLのDigitonin Bufferを新たに調製して氷上に置いてください。
  注意：ここで調製したDigitonin BufferをセクションIVとVの両方で使用します。

1. 二次抗体のプレミックスを作製してください。1反応につき、Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody #35401 1 µLまたはDonkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody #52885 1 µLを50 µLのDigitonin Bufferで希釈しください。反応数に比例して、二次 抗体プレミックスをスケールアップしてください。ピペッティングで上下させて混合し、氷上に置いてください。
2. セクションIIIのステップ7の、一次抗体の入ったサンプルチューブを 磁気ラックに30秒間から2分間置き、その後上清を除去して廃棄してください。
3. 各サンプルチューブに二次抗体プレミックス50 µLを加えて、ピペッティングで穏やかに上 下させてサンプルを混合してください。
4. サンプルを30分間、室温でインキュベートしてください。
5. 速やかにセクションVに進んでください。

V. pAG-Tn5酵素の結合とタグメンテーション

実験開始前の準備：

! すべてのバッファーの量は、実施する CUT&Tag反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。

• 10% SDS Solution #20533が完全に溶解していることを確認してください。37°Cに温めることで SDSの沈殿が溶解しやすくなります。
• Digitonin Solution #16359を90-100°Cで5分間温めて、完全に 解凍されて溶解していることを確認してください。解凍したDigitonin Solution #16359はすぐに氷上に置き、使用中は氷上で保持してください。その日の作業が終了したら-20°Cで保管してください。
• 使用前にProtease Inhibitor Cocktail (200X) #7012および100X Spermidine #27287を完全に解凍し、その日の作業が終了したら-20°Cで保管してください。 Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012はDMSO含有のため、 氷上に置くと再凍結することに注意してください。
• 1反応につきHigh Salt Digitonin Buffer 1.2 mLを加えて、氷上に置いてください。

• 1反応につきTagmentation Buffer 150 µLを加えて、氷上に置いてください。

1. 1反応につき、CUT&Tag pAG-Tn5 (Loaded) #79561 2 µLを50 µLのHigh Salt Digitonin Bufferで希釈して、pAG-Tn5プレミックスを作製してください。反応数に比例して、 pAG-Tn5プレミックスを増やしてください。ピペッティングで上下させて混合し、氷上に置いてください。
2. セクションIVステップの、二次抗体インキュベーション溶液の入ったサンプルチューブを磁気ラックに30秒間から2分間置き、その後上清を除去して廃棄してください。
3. チューブを磁気ラックから外してください。セクションIVで調製したDigitonin Buffer 500 µLを加えてください。ピペッティングで穏やかに上下させてビーズを 再懸濁してください。
4. チューブを磁気ラックに30秒間から2分間置き、その後上清を除去して廃棄してください。
5. ステップ3、4をもう1度繰り返し、2度目の洗浄を実施してください。
6. チューブを磁気ラックから外してください。各チューブにpAG-Tn5プレミックス 50 µLを加えて、 ピペッティングで穏やかに上下させてサンプルを混合してください。
7. 1時間、室温でインキュベートしてください。
8. チューブを磁気分離ラックに30秒間から2分間置き、その後 上清を除去して廃棄してください。
9. チューブを磁気分離ラックから外してください。High Salt Digitonin Buffer 500 µLを加えて、 ピペッティングで穏やかに上下させてビーズを再懸濁してください。
10. チューブを磁気ラックに30秒間から2分間置き、その後上清を除去して廃棄してください。
11. ステップ9、10をもう1度繰り返し、2度目の洗浄を実施してください。
12. チューブを磁気ラックから外してください。各チューブにTagmentation Buffer 150 µLを加えて、ピペッティングで上 下させて混合してください。
13. サンプルを37°Cで1時間、インキュベートしてください。
14. タグメンテーションを停止するには、各サンプルに0.5 M EDTA, pH 8.0 #7011 6.75 µL、10% SDS Solution #20533 8.25 µL、Proteinase K (20 mg/mL) #10012 1.5 µLを加え、軽くボルテックスして混合してください。
15. サンプルを58°Cで1時間インキュベートして、タグ付けされたクロマチン断片を溶液中に放出させてください。このインキュベーションは、 一晩かけて行うことができます。一晩インキュベートする場合は、サンプルの蒸発を防ぐためにセーフロックチューブを使用してください。

    注意：固定細胞または組織サンプルで開始する場合、サンプルを セーフロックチューブ内で65°Cで2時間インキュベートし、十分に脱クロスリンクしてください。インキュベーションは一晩まで延長することができます。

16. チューブを16,000 x gで2分間、室温で遠心分離し、30 秒間から2分間磁気ラックに置いてください。
17. 上清を新しい1.5 mLチューブに移してください。これが、精製前のCUT&Tag DNAサンプルです。
18. セクションVIに進んでください。(​​SAFE STOP​) あるいはサンプルを-20°Cで最長1週間 まで保存できます。ただし、DNAの精製 (セクションVI) に移る前に、サンプルを必ず室温まで温めてください。

VI. DNAの精製

実験開始前の準備：

!! 使用前にDNA Binding Bufferにイソプロパノール8 mLを加えてください。この 手順をスキップすると、DNAサンプルが全量失われます。このステップは、DNA精製を開始する 前に1回だけ行ってください。

!! 使用前に、DNA Wash Bufferにエタノール (96-100%) 24 mLを加えてください。このステップは、DNA精製を開始する 前に1回だけ行ってください。

• DNA Purification Columns、DNA Binding Buffer、DNA Wash Buffer、DNA Elution Bufferを、使用前に 室温に戻してください。

1. 精製するCUT&Tag DNA 1サンプルにつき、DNA精製コレクションチューブ1個を使用してください。
2. 各CUT&Tag DNAサンプルにDNA Binding Buffer (+ イソプロパノール) 833 µLを加え、ピペッティングで上下させて混合してください。

   注意：1サンプルあたり5倍量のDNA Binding Buffer (+ イソプロパノール) を 使用します。

3. ステップ1のサンプル600 µLをそれぞれ、コレクションチューブにセットした各DNAスピンカラムに移してください。
4. 18,500 x gで30秒間遠心分離してください。
5. コレクションチューブから各スピンカラムを取り外し、液体を廃棄してください。空になった コレクションチューブにスピンカラムを再セットしてください。
6. ステップ1のサンプル全量がスピンカラムで遠心分離されるまで、ステップ2-4を繰り返してください。空になったコレクションチューブにスピン カラムを再度セットしてください。
7. DNA Wash Buffer (+エタノール) 750 µLをコレクションチューブにセットした各スピンカラムに加えてください。
8. 18,500 x gで30秒間遠心分離してください。
9. コレクションチューブから各スピンカラムを取り外し、液体を廃棄してください。空になった コレクションチューブにスピンカラムをセットしてください。
10. 18,500 x gで30秒間遠心分離してください。
11. コレクションチューブと液体を廃棄してください。スピンカラムは廃棄しないでください。
12. 各スピンカラムを清潔な1.5 mLチューブにセットし、DNA Elution Buffer 30 µLを加えてください。

    注意：注：カラムからDNAを完全に溶出するには、最低30 µLのDNA Elution Bufferが必要です。

13. 微量遠心分離機を用いて、18,500 x gで30秒間遠心分離して、DNAを溶出してください。
14. 各DNAスピンカラムを取り外し、廃棄してください。得られた溶出液が精製されたDNAです。(SAFE STOP) サンプル は、-20°Cで最長6か月間保存できます。

    注意：CUT&Tag DNAの収量は一般的に低いことを考慮し、ライブラリー増幅に DNAサンプル 30 µLをすべて使用することを強く推奨します。

VII. 次世代シーケンシング (NGS) 用ライブラリーの構築

本キットを用いて調製した免疫濃縮DNAサンプルは、直接NGSに使用できます。NGS用DNA ライブラリーの構築の際は、使用予定のシーケンス プラットフォームと互換性のあるDNAライブラリー調製プロトコールまたはキットを用いて行ってください。Illumina Systemsプラットフォームでのシーケンシングには、CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina Systems #47415の使用を推奨します。DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795およびMultiplex Oligos for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580または#47538 は、CUT&Tag DNAサンプルに適合しないので注意してください。

DNAライブラリーの調製に関するその他の推奨事項：

• 増幅されたCUT&Tag DNAライブラリーの収量は、用いるDNA定量の手法によって異なります。
• NanoDropまたはQIAxpert Systemを使用する場合、予想されるライブラリー濃度は、標的がヒストンであれば10-20 ng/µL、ヒストン以外であれば 5-12 ng/µLです。NanoDropまたはQIAxpert Systemでのライブラリー濃度が<3 ng/µLの場合は、サンプルをシーケンシングする前に トラブルシューティングガイドを参照してください。
• Qubit Fluorometric Quantification systemまたはPicogreenアッセイを使用する場合、予想されるライブラリー濃度は、標的がヒストンであれば 3-10 ng/µL、ヒストン以外であれば<1 ng/µLです。
• 収量の異なるサンプルのプールに関するより詳しい情報は、 弊社のCUT&Tagのよくある質問のウェブページを参照してください。
• CUT&Tagアッセイで得られたDNA収量が低く、DNAライブラリーの品質評価が困難な場合が あります。
• Bioanalyzerシステムを使用する場合、DNA濃度が非常に低いライブラリーでは、特に細胞内の存在量が低い標的のピークが非常に弱い、またはピークが全く見られない ことがあります。そのような 場合でも、Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit Monoclonal Antibody #9751などのポジティブコントロールで期待通りのライブラリーの収量が得られる、 または Bioanalyzerでピークが得られて実験が全体的に成功していることを示す場合は、NGSに進むことを推奨します。
• TapeStationシステムのHigh Sensitivity ScreenTapeアッセイは、蛍光化学反応が最適化されておりベースラインノイズを低減するため、CUT&Tag ライブラリーの品質評価に優れた手法になります。
• 標的の種類に関わらず、 シーケンシング深度は通常1サンプルにつき200万リードで十分です。シーケンシング深度が1サンプルあたり1,500万個 以上の場合、リードの重複率が大幅に上昇します。シーケンシング深度が 1サンプルあたり<100万個の場合は、S/N比が低下します。
• 開始時の細胞数が<20,000個の場合は、一般的にNGSで得られるリードのマッピング率が低下するか、 重複率が上昇します。このような場合、下流のデータ解析に十分な量の ユニークマッピングリードを得るために、シーケンシング深度を上げることを推奨します。
• ショウジョウバエ核のSpike-inを用いてサンプルを正規化する実施する場合、 NGS解析に関する追加のガイダンスについては、Drosophila Spike-In Control Kit for CUT&Tag (Rabbit) #29811 またはDrosophila Spike-In Control Kit for CUT&Tag (Mouse) #19629 のプロトコールのセクションIIIを参照してください。

APPENDIX A：固定細胞のサンプル調製

可能な限り生細胞を用いることを強く推奨します。Concanavalin Aにより損傷を受ける、あるいは感受性のある 細胞タイプの場合は、CUT&Tag実験前に細胞を軽く固定する下記のプロトコールを参照してください。 細胞の固定は、CUT&Tagシグナルを大幅に増加させるわけではないことに注意してください。過剰な固定は、 CUT&Tagのシグナルを弱める可能性があります。各反応に 用いる適切な細胞数を決定するには、セクションIIに記載の内容を参照してください。

注意：固定細胞サンプルの調製には、 本キットに含まれない次の試薬が必要です：37% Formaldehydeまたは16% Formaldehyde Methanol-Free #12606およびGlycine Solution (10X) #7005

実験開始前の準備：

! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&Tag反応数に応じて比例的に増加させる必要があります。

• 固定処理を行う細胞懸濁液1 mLにつき、37% Formaldehydeを2.7 µLまたは16% Formaldehyde Methanol-Free #12606を6.25 µL取り分け、室温 で保持してください。メーカーが示す使用期限内の新しいホルムアルデヒドを使用してください。
• 使用前にProtease Inhibitor Cocktail (200X) #7012および100X Spermidine #27287を完全に解凍し、その日の作業が終了したら-20°Cで保管してください。 Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012はDMSO含有のため、 氷上に置くと再凍結することに注意してください。
• Complete Wash Buffer (1細胞調製サンプルにつき2 mL、さらにCUT&Tag 1反応につき100 µLが必要) を調製し、室温で保持してください。例えば、未処理および薬剤処理した細胞の両方 (2 サンプルの細胞調製) と、4種類の抗体 (ポジティブコントロールのH3K4me3 #9751、ネガティブコントロールのIgG #2729または#68860、および2種類の実験用抗体) を用いた8反応で試験する場合は、合計4.8 mLの Complete Wash Bufferが必要です。

1. 1反応につき100,000個の生細胞を用意してください。

   注意：接着細胞を回収する場合は、トリプシン処理で細胞を培養ディッシュから剥離させた後、 3倍量以上の組織培養液で反応を停止してください。細胞の溶解を防ぐため、 培養ディッシュから細胞を掻き取ることをCSTは推奨しません。正確な数の細胞を実験に用いるため、 血球計算盤やその他の細胞計数装置で細胞数を正確にカウントしてください。

2. 細胞懸濁液1 mLにつき、37% Formaldehydeを2.7 µLまたは16% Formaldehyde Methanol-Free #12606を6.25 µL加え、ホルムアルデヒド の最終濃度が0.1%となるように調整してください。チューブを転倒混和しながら室温で2分間インキュベートしてください。
3. 固定処理した細胞懸濁液 1 mLあたり、Glycine Solution (10X) #7005を100 µL加え、クロスリンクを停止してください。チューブを転倒混和し、室温で5分間インキュベートしてください。
4. 細胞懸濁液を3,000 x gで3分間、4°Cで遠心分離し、上清を除去して廃棄してください。 速やかにステップ5に進んでください。(SAFE STOP) 固定した細胞ペレットは、使用するまで -80°Cで最長6か月間保存できます。

   注意：使用細胞数が少なく (100,000個未満)、遠心分離で集めた細胞ペレットが 肉眼で確認できない場合は、細胞ペレットの凍結保存を推奨しません。プロトコールを 継続して、下記の洗浄ステップ5-7を省略することを推奨します。ステップ4で行う最初の細胞懸濁液の遠心分離後、上清の大部分を除去して廃棄し、1反応につき≤40 µLの細胞培地を残してください。続くステップ8で、適量のComplete Wash Bufferを加え、細胞懸濁液の 総量を1反応あたり100 µLにしてください。

5. Complete Wash Buffer 1 mLを加えて、ピペッティングで穏やかに上下させて細胞ペレットを再懸濁してください。
6. 3,000 x gで3分間、4°Cで遠心分離して、上清を除去し廃棄してください。
7. ステップ5-6を繰り返して、もう1度細胞ペレットを洗浄してください。
8. 1反応につきComplete Wash Buffer 100 µLを加えて、ピペッティングで穏やかに上 下させて細胞ペレットを再懸濁してください。
9. 速やかにセクションIIIに進んでください。

APPENDIX B：固定組織のサンプル調製

大半の組織タイプにおいて、1 mgの新鮮な組織でヒストンを十分に濃縮できます。新鮮な 組織が使用できない場合は、軽く固定した組織 (0.1%ホルムアルデヒドで2分間) を使用してください。固定した組織サンプルは 、凍結することにより使用するまで-80°Cで最長6か月間保存できます。過剰な固定はCUT&Tagシグナルを弱める場合があります。 CUT&Tagアッセイは、組織の転写因子およびコファクターの濃縮には適していません。 転写因子およびコファクターの解析には、CUT&RUN アッセイキット #86652の使用を推奨します。

注意：固定組織サンプルの調製には、 本キットに含まれない次の試薬が必要です：37%ホルムアルデヒドまたは16% ホルムアルデヒド、Methanol-Free #12606、Phosphate Buffered Saline (PBS-1X) pH7.2 (Sterile) #9872、Glycine Solution (10X) #7005

実験開始前の準備：

! すべてのバッファーの量は、実施する CUT&Tag反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。

• 固定処理を行う細胞懸濁液1 mLにつき、37% Formaldehydeを2.7 µLまたは16% Formaldehyde Methanol-Free #12606を6.25 µL取り分け、室温 で保持してください。メーカーが示す使用期限内の新しいホルムアルデヒドを使用してください。
• 固定バッファー1 mLにつき、Glycine Solution (10X) #7005 100 µLを調製してください。
• 使用前にProtease Inhibitor Cocktail (200X) #7012および100X Spermidine #27287を完全に解凍し、その日の作業が終了したら-20°Cで保管してください。 Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012はDMSO含有のため、 氷上に置くと再凍結することに注意してください。
• Complete Wash Buffer (組織調製1サンプルあたり3 mL、さらに1反応につき100 µLが必要) を調製し、細胞のストレスを最小限にするために 室温で保持してください。

• 1組織タイプにつき1 mLの固定バッファーを調製してください。 メーカーが示す 使用期限内の新しいホルムアルデヒドを使用してください。

• 1組織あたりFixation Wash Bufferを1 mL調製し、氷上に置いてください。

1. 新鮮組織を、1反応につき1 mg測り取ってください。
2. 組織サンプルをシャーレに置き、清潔な解剖用メスまたは剃刀の刃で細かく切り刻んでください。ディッシュは氷上で保持してください。 タンパク質分解を防ぐため、組織をよく冷やすことが重要です。
3. 刻んだ組織を速やかにFixation Buffer 1 mLに移し、チューブを転倒混和してください。

   注意：これは、最大50 mgの組織に十分な固定バッファーの量です。50 mgを 超える組織を処理する場合は、ステップ3のFixation Bufferと ステップ7のFixation Wash Bufferを適切にスケールアップしてください。

4. 室温で2分間インキュベートしてください。
5. 固定バッファー 1 mLあたり、Glycine Solution (10X) #7005 100 µLを加えてクロスリンクを停止してください。チューブを転倒混和し、室温で5分間インキュベートしてください。
6. 2,000 x gで5分間、4°Cで組織を遠心分離して、上清を除去し廃棄してください。
7. 組織をFixation Wash Buffer 1 mLで再懸濁します。
8. 2,000 x gで5分間、4°Cで遠心分離して、上清を除去して廃棄し、ステップ9に進んでください。 (​​SAFE STOP​) あるいは、固定した組織ペレットは、解離する前に-80°Cで最長6か月間 保存できます。
9. 組織をComplete Wash Buffer 1 mLで再懸濁し、サンプルをDounce Homogenizerに移してください。
10. 組織片を、シングルセル懸濁液になるまで破砕してください。20-25ストロークで、組織の塊が見られなくなるまで 破砕してください。
11. 細胞懸濁液を1.5 mLチューブに移し、3,000 x gで3分間、室温で遠心分離して、 細胞から上清を除去し廃棄してください。
12. Complete Wash Buffer 1 mLで細胞ペレットを再懸濁してください。
13. 細胞懸濁液を3,000 x gで3分間、室温で遠心分離し、上清を 除去して廃棄してください。
14. ステップ12-13を繰り返して、もう1度細胞ペレットを洗浄してください。
15. 1反応につきComplete Wash Buffer 100 µLを加えて、ピペッティングで穏やかに上 下させて細胞ペレットを再懸濁してください。
16. 速やかにセクションIIIに進んでください。

APPENDIX C：細胞のジギトニンに対する感受性の決定

CUT&Tagプロトコールでは、ジギトニンをバッファーに添加することで細胞膜を透過化し、 一次抗体や二次抗体、pAG-Tn5酵素の細胞や核への進入を促進します。そのため、抗体と酵素の結合および 標的ゲノム遺伝子座の消化を成功させるには、バッファーに 適量のジギトニンを含めることが不可欠です。各細胞株は、ジギトニンの細胞 透過化に対して異なる感受性を示します。本プロトコールで推奨されているジギトニンの量は、ほぼ全ての細胞株や組織の 透過化に十分ですが、下記の プロトコールを用いて、使用する特定の細胞株や組織のジギトニン感受性試験を行うこともできます。ジギトニンの過剰添加はアッセイに対して有害ではないことが分かっているため、 濃度曲線を作成する必要はありません。推奨されるジギトニンの量が 使用する細胞株に十分かどうかは、簡単な試験で判断できます。

実験開始前の準備：

• Digitonin Solution #16359を90-100°Cで5分間温め、完全に 解凍されて溶解していることを確認してください。解凍したDigitonin Solution #16359はすぐに氷上に置き、使用中は氷上で保持してください。その日の作業が終了したら-20°Cで保管してください。
• 1反応あたり100 µLの1X Wash Bufferを調製してください。この試験には、100X Spermidine #27287やProtease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 を加える必要はありません。

1. 1.5 mLチューブ内に10万個の細胞を回収し (セクションII-Aのステップ1)、600 x gで3分間、室温 で遠心分離し、上清を除去してください。組織の場合は、1 mgの組織から解離した細胞を回収してください ( セクションII-B、ステップ1-8)。
2. 1X Wash Buffer 100 µLに細胞ペレットを再懸濁してください。
3. 1反応につき、Digitonin Solution #16359を2.5 µL加え、室温で10分間 インキュベートしてください。
4. 細胞懸濁液10 µLと0.4%トリパンブルー色素10 µLを混合してください。
5. 血球計算盤またはセルカウンターを使用して、染色された細胞数と細胞総数を計測してください。 透過化が十分であれば、90%超の細胞がトリパンブルーで染色されます。
6. トリパンブルーで染色された細胞数が<90%の場合は、各反応に加えるDigitonin Solution #16359の量を増加させて、90%超の細胞が 透過化および染色されるまでステップ1-5を繰り返してください。セクションIII-Vでは、 この量のDigitonin Solution #16359を使用してください。

APPENDIX D：トラブルシューティングガイド

詳細なトラブルシューティングガイドについては、 cellsignal.com/learn-and-support/troubleshooting/cutandtag-troubleshooting-guide をご覧ください。

APPENDIX E：オンラインリソース

CUT&Tagアッセイに関するブログ、よくある質問および詳細情報については、弊社のCUT&Tagリソースセンター ( cellsignal.com/applications/cut-tag) か、下記のQRコードをスキャンしてご覧ください。

CUT&Tag provided under a license from Active Motif, Inc. under U.S. Patent No. 10,689,643 and 9,938,524, foreign equivalents, and child patents deriving therefrom. For purchaser's internal research use only. May not be used for resale, services, or other commercial use.

U.S. Patent No. 11,733,248, foreign equivalents, and child patents deriving therefrom.

For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.