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CUT&RUNキットのプロトコール

CUT&RUNキットのプロトコール

!	この!マークは、実施するCUT&RUN反応の数に応じて量を変更する、プロトコール中の重要なステップであることを意味します。
!!	この!!マークは、操作を進める前にバッファーを希釈する、重要なステップであることを意味します。
SAFE STOP	これは、実験操作を中断する必要がある場合に、プロトコールを安全に中断できるポイントを示します。

I. Concanavalin Aビーズの活性化

実験開始前の準備：

! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&RUN反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。

Concanavalin A Bead Activation Bufferを氷上で保持してください。

実施するCUT&RUN反応の数を決定してください。ポジティブコントロールのTri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit Monoclonal Antibody #9751およびネガティブコントロールのRabbit (DA1E) Monoclonal Antibody IgG Isotype Control (CUT&RUN) #66362を含めることを強く推奨します。
Concanavalin A磁気ビーズを、ビーズ懸濁液がチューブからこぼれないように慎重にピペッティングで上下させて再懸濁してください。
注意：Concanavalin A磁気ビーズ懸濁液はボルテックスしないでください。ボルテックスを繰り返すと、Concanavalin Aがビーズから外れてしまう場合があります。

CUT&RUN 1反応につきビーズ懸濁液10 µLを、新しい1.5 mLチューブに移してください。一度に14回を超えるCUT&RUN反応を行う場合は、2本以上の1.5 mLチューブを使用してください。各1.5 mLチューブに140 µL以上のConcanavalin Aビーズを入れないでください。
ビーズ10 µLにつき、Concanavalin A Bead Activation Buffer 100 µLを加えてください。ピペッティングで穏やかに上下させてビーズを混合してください。
チューブを溶液が透明になるまで磁気ラックに置き (30秒間から2分間)、その後、液体を除去して廃棄してください。
注意：ビーズの損失を避けるため、プロトコールのいずれの時点においても真空吸引はしないでください。

チューブを磁気ラックから外してください。ステップ4-5をもう一度繰り返して、2回目のビーズの洗浄を実施してください。
ビーズ懸濁液の最初の量と同量 (1サンプルにつき10 µL) のConcanavalin A Bead Activation Bufferを加えて、ピペッティングで上下させて再懸濁してください。
注意：活性化させたビーズは氷上で最長8時間保管できます。

II. 細胞と組織のサンプルの調製

ほとんどの細胞タイプにおいて、CUT&RUNアッセイに生細胞を用いることにより、ヒストンや転写因子、コファクターを安定して濃縮できます。Concanavalin Aより損傷を受ける、またはConcanavalin Aへの感受性が高い細胞の場合は、軽く固定することにより細胞を無傷のまま保持できます。また、新鮮な細胞を用いても安定したシグナルがみられない場合に、固定により、存在量の少ない、あるいは結合力の弱い転写因子やコファクターの濃縮が促進されることがあります。細胞の過剰な固定はCUT&RUNアッセイを阻害する可能性があることに注意してください。

弊社のCUT&RUNアッセイは、広範な細胞や組織サンプルで機能します。プロトコールに記載されているように、1反応につき5,000-250,000個の細胞または1-5 mgの組織でCUT&RUNを実施できます。この範囲であれば、プロトコール全体を通して使用するバッファーの量を1反応あたりの細胞や組織の量に応じて調整する必要はありません。指示がある場合には、実施する反応の数に応じてバッファーの量を比例的に増やしてください。可能であれば、1反応につき100,000個の細胞または1 mgの組織を使用することを推奨します。細胞数に限りがある場合やヒストン修飾の解析の場合には、1反応につき少なくとも5,000-10,000個の細胞、転写因子やコファクターの解析には1反応あたり10,000-20,000個の細胞を使用することを推奨します。

A. 生細胞サンプルの調製

実験開始前の準備：

! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&RUN反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。

Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 (PIC) と100X Spermidine #27287を取り出して温めてください。どちらも必ず完全に解凍してください。Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012はDMSO含有のため、氷上に置くと再凍結することに注意してください。
1X Wash Buffer (1細胞株あたり2 mL、1反応あるいは1インプットサンプルにつき追加で100 µL) を調製してください。例えば、1X Wash Buffer 2.5 mLを調製する場合は、10X Wash Buffer #31415 250 µL + 100X Spermidine #27287 25 µL + Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 12.5µL + Nuclease-free Water #12931 2,212.5 µLを加えてください。細胞へのストレスを最小限にするため、室温に戻してください。

注意：生細胞 (未固定) サンプル調製のステップは、細胞へのストレスを最小限にするため、室温で連続して行う必要があります。DNAの断片化を最小限にするため、再懸濁する場合には激しいボルテックスやサンプルのキャビテーション (気泡の発生) を避けてください。

細胞ストレスを最小限にするために、新鮮な培養細胞を室温で回収してください。1反応につき5,000-100,000個の細胞を回収し、さらにインプットサンプルの調製用に5,000-100,000個の細胞を回収してください。必ず、ポジティブコントロールのTri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit Monoclonal Antibody #9751とネガティブコントロールのRabbit (DA1E) Monoclonal Antibody IgG Isotype Control (CUT&RUN) #66362の反応を含めてください。
注意：接着細胞を回収する場合は、トリプシン処理で細胞を培養ディッシュから剥離させた後、3倍量以上の組織培養液で反応を停止させてください。細胞をスクレイパーで培養ディッシュから掻き取ると、細胞にストレスを与えて溶解させてしまう可能性があるため、CSTはこれを推奨しません。正確な数の細胞を実験に用いるために、血球計算盤やその他の細胞計数装置で細胞数をカウントしてください。

細胞懸濁液を600 x gで3分間、室温で遠心分離し、液体を除去して廃棄してください。
注意：総細胞数が100,000個未満で開始した際に、遠心分離した細胞ペレットが眼で見えない場合は、洗浄ステップ中に細胞を喪失してしまいやすくなります。したがって、少数の細胞で実験を進める場合は下記ステップ3-5の洗浄ステップの省略を推奨します。懸濁液に40%の細胞培地が混入していても Concanavalin Aビーズと細胞は結合します。そのため、ステップ2の細胞懸濁液の初めの遠心分離の後に、上清の大部分を除去して廃棄し、1反応あたり≤40 µLの細胞培地を残すことができます。この場合、ステップ6で細胞懸濁液に十分量の1X Wash Buffer (+ Spermidine + PIC) を加え、1反応あたりの合計容量を100 µLにしてください。

1X Wash Buffer (+ Spermidine + PIC) 1 mLを室温で加え、ピペッティングで静かに上下させて細胞ペレットを再懸濁してください。
600 x gで3分間、室温で遠心分離し、液体を除去して廃棄してください。
ステップ3と4を繰り返して、もう1度細胞ペレットを洗浄してください。
1反応または1インプットサンプルあたり、1X Wash Buffer (+ Spermidine + PIC) 100 µLを加え、ピペッティングで静かに上下させて細胞ペレットを再懸濁してください。
細胞100 µLを新しいチューブに移し取り、セクションVを実施するまで4°Cで保存してください。これがインプットサンプルになります。
注意：このインプットサンプルは、後のプロトコールで55°Cでインキュベートするため、インキュベート中の蒸発を減少させるためセーフロックの付いた1.5 mLチューブを使用することを推奨します。

速やかにセクションIIIに進んでください。

B.固定細胞サンプルの調製

注意：固定細胞サンプルの調製には、本キットに含まれない次の試薬が必要です：37% Formaldehydeまたは16% Formaldehyde Methanol-Free #12606、Glycine Solution (10X) #7005、10% SDS Solution #20533

実験開始前の準備：

! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&RUN反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。

Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012と100X Spermidine #27287を取り出して温めてください。どちらも必ず完全に解凍してください。Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012はDMSO含有のため、氷上に置くと再凍結することに注意してください。
1X Wash Buffer (1細胞株あたり2 mL、1反応あるいは1インプットサンプルあたり追加で100 µL) を調製してください。例えば、1X Wash Buffer 2.5 mLを調製する場合は、10X Wash Buffer #31415 250 µL + 100X Spermidine #27287 25 µL + Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 12.5µL + Nuclease-free Water #12931 2,212.5 µLを加えてください。細胞へのストレスを最小限にするため、室温に戻してください。
固定処理を行う細胞懸濁液1 mLあたり、37% Formaldehydeを2.7 µLまたは16% Formaldehyde Methanol-Free #12606を6.25 µL取り分け、室温で保持してください。メーカーが示す使用期限内の新しいホルムアルデヒドを使用してください。

1抗体反応につき5,000-100,000個の細胞を回収し、さらにインプットサンプルの調製用に5,000-100,000個の細胞を回収してください。必ず、ポジティブコントロールのTri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit Monoclonal Antibody #9751とネガティブコントロールのRabbit (DA1E) Monoclonal Antibody IgG Isotype Control (CUT&RUN) #66362の反応を含めてください。
注意：接着細胞株を回収する場合は、トリプシン処理で細胞を培養皿から剥離させた後、3倍量以上の組織培養液で反応を停止させてください。細胞をスクレイパーで培養ディッシュから掻き取ると、細胞にストレスを与えて溶解させてしまう可能性があるため、CSTはこれを推奨しません。正確な数の細胞を実験に用いるために、血球計算盤やその他の細胞計数装置で細胞数をカウントしてください。

細胞懸濁液1 mLあたり、37% Formaldehydeを2.7 µLまたは16% Formaldehyde Methanol-Free #12606を6.25 µL加え、ホルムアルデヒドの最終濃度が0.1%となるように調整してください。チューブを転倒混和しながら室温で2分間インキュベートしてください。
固定処理した細胞懸濁液1 mLあたり、Glycine Solution (10X) #7005を100 µL加え、クロスリンクを停止してください。チューブを転倒混和しながら室温で5分間インキュベートしてください。
細胞懸濁液を3,000 x gで3分間、4°Cで遠心分離して、液体を除去し廃棄してください。速やかにステップ5に進んでください。(SAFE STOP) 固定した細胞ペレットは、使用するまで-80°Cで最長6か月間保存できます。
注意：総細胞数が100,000個未満で開始した際に、遠心分離した細胞ペレットが眼で見えない場合は、洗浄ステップ中に細胞を喪失してしまいやすくなります。この場合は、細胞ペレットの凍結保存を推奨しません。また、このような少数の細胞で実験を進める場合は下記ステップ5-7の洗浄操作を省略することを推奨します。懸濁液に40%の細胞培地が混入していても Concanavalin Aビーズと細胞は結合します。このため、ステップ4の細胞懸濁液の初めの遠心分離の後に、上清の大部分を除去して廃棄し、1反応あたり≤40 µLの細胞培地を残すことができます。この場合、ステップ8で細胞懸濁液に十分量の1X Wash Buffer (+ Spermidine + PIC) を加え、1反応あたりの合計容量を100 µLにしてください。

1X Wash Buffer (+ Spermidine + PIC) 1 mLを加え、ピペッティングで穏やかに上下させて細胞ペレットを再懸濁してください。
3,000 x gで3分間、4°Cで遠心分離して、液体を除去し廃棄してください。
ステップ5-6を繰り返して、もう1度細胞ペレットを洗浄してください。
1反応または1インプットサンプルにつき、1X Wash Buffer 100 µL
(+ spermidine + PIC) を加え、ピペッティングで静かに上下させて細胞ペレットを再懸濁してください。
細胞100 µLを新しいチューブに移し取り、セクションVを実施するまで4°Cで保存してください。これがインプットサンプルになります。
注意：このインプットサンプルは、後のプロトコールで55°Cでインキュベートするため、インキュベート中の蒸発を減少させるためセーフロックの付いた1.5 mLチューブを使用することを推奨します。

速やかにセクションIIIに進んでください。

C.組織サンプルの調製

ほとんどの組織タイプにおいて、軽く固定した (0.1%ホルムアルデヒドで2分間) 組織1 mgを用いることにより、ヒストンや転写因子、コファクターを安定して濃縮できます。ヒストン修飾の濃縮の場合は、ホルムアルデヒド固定は必須ではありません。しかし、多くの転写因子やコファクターの場合、軽く固定することで最適な結果が得られます。存在量の少ない、あるいは結合力の弱い転写因子やコファクターの場合は、中程度の固定 (0.1%ホルムアルデヒドで10分間) が必要なこともあります。また、線維組織のような難しい組織を使用する場合には、中程度の固定によって結果が改善されることがあります。過剰な固定はCUT&RUNアッセイを阻害することに注意してください。固定した組織サンプルは、凍結することにより使用するまで-80°Cで最長6か月間保存できます。

注意：固定組織サンプルの調製には、本キットに含まれない次の試薬が必要です：37%ホルムアルデヒドまたは16% Formaldehyde Methanol-Free #12606、Phosphate Buffered Saline (PBS-1X) pH7.2 (Sterile) #9872、Glycine Solution (10X) #7005、および10% SDS Solution #20533

実験開始前の準備：

!すべてのバッファーの量は、実施するCUT&RUN反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。

Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012と100X Spermidine #27287を取り出して温めてください。どちらも必ず完全に解凍してください。Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012はDMSO含有のため、氷上に置くと再凍結することに注意してください。
1X Wash Buffer (1組織タイプにつき3 mL、1反応あるいは1インプットサンプルあたり追加で100 µL) を調製してください。例えば、1X Wash Buffer 3.5 mLを調製する場合、10X Wash Buffer #31415 350 µL + 100X Spermidine #27287 35 µL + Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 17.5µL + Nuclease-free Water #12931 3,097.5 µLを加えてください。細胞へのストレスを最小限にするため、室温に戻してください。
組織の固定が必要な場合は次のバッファーを調製してください：
- 1組織タイプにつき1 mLの固定バッファーを調製してください。Phosphate Buffered Saline (PBS-1X) pH7.2 (Sterile) #9872 1 mLに、37% formaldehyde 2.7 µLまたは16% Formaldehyde Methanol-Free #12606 6.25 µLおよびProtease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 5 µLを加えてください。メーカーが示す使用期限内の新しいホルムアルデヒドを使用してください。
- 1組織タイプにつき、Phosphate Buffered Saline (PBS-1X) pH7.2 (Sterile) #9872 1 mL + Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 5 µLを調製し、氷上で保持してください。
- 固定バッファー1 mLにつき、Glycine Solution (10X) #7005 100 µLを調製してください。

1抗体反応あたり新鮮な組織を1 mg測り取り、さらにインプットサンプル調製用に1 mgを測り取ってください。必ず、ポジティブコントロールのTri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit Monoclonal Antibody #9751とネガティブコントロールのRabbit (DA1E) Monoclonal Antibody IgG Isotype Control (CUT&RUN) #66362の反応を含めてください。
注意：転写因子やコファクターを解析する場合や、線維組織のような難しい組織を使用する場合は、1反応あたり5 mgまでの組織を試薬量を増やすことなく使用することができます。
組織サンプルをシャーレに置き、清潔な解剖用メスまたは剃刀の刃で細かく切り刻んでください。ディッシュは氷上で保持してください。タンパク質分解を防ぐため、組織をよく冷やす必要があります。
注意：組織タイプや標的タンパク質のほとんどは、軽く固定することで最適な結果が得られます。このため、次の軽く固定するプロセスを推奨します。しかし、新鮮な組織 (未固定) が望ましい場合は、ステップ3-8を省略して直ちにステップ9に進んでください。
刻んだ組織を速やかにFixation Buffer 1 mLに移し、チューブを転倒混和してください。
注意：これは、最大50 mgの組織に十分な固定バッファーの量です。>50 mgの組織を処理する場合は、固定バッファーとステップ7の1X PBS+PIC液をスケールアップしてください。
室温で2分間インキュベートしてください。
注意：線維組織などの難しい組織を使用する場合や、存在量の少ないあるいは結合力の弱い転写因子やコファクターを解析する場合は、ホルムアルデヒドによる固定を10分間に延長することで結果が改善されることがあります。
固定バッファー1 mLにつき、Glycine Solution (10X) #7005 100 µLを加えてクロスリンクを停止してください。チューブを転倒混和しながら室温で5分間インキュベートしてください。
2,000 x gで5分間、4°Cで組織を遠心分離して、液体を除去し廃棄してください。
1X PBS+PIC 1 mLに組織を再懸濁してください。
2,000 x gで5分間、4°Cで遠心分離して、液体を除去し廃棄し、ステップ9に進んでください。(SAFE STOP) 固定した組織ペレットは、解離する前に-80°Cで最長6か月間保存できます。
組織を1X Wash Buffer (+ Spermidine + PIC) 1 mLで再懸濁し、サンプルをDounce Homogenizerに移してください。
組織片を、シングルセル懸濁液になるまで破砕してください。20-25ストロークで、組織の塊が見られなくなるまで破砕してください。
細胞懸濁液を1.5 mLチューブに移し、3,000 x gで3分間、室温で遠心分離して、細胞から上清を除去して廃棄してください。
細胞ペレットを1X Wash Buffer (+ Spermidine + PIC) 1 mLで再懸濁してください。
細胞懸濁液を3,000 x gで3分間、室温で遠心分離して、液体を除去し廃棄してください。
ステップ12-13を繰り返して、もう1度細胞ペレットを洗浄してください。
各反応あたり、1X Wash Buffer (+ Spermidine + PIC) 100 µLを加え、ピペッティングで静かに上下させて細胞ペレットを再懸濁してください。
細胞100 µLを新しいチューブに移し取り、セクションVを実施するまで4°Cで保存してください。これがインプットサンプルになります。
注意：このインプットサンプルは、後のプロトコールで55°Cでインキュベートするため、インキュベート中の蒸発を減少させるためセーフロックの付いた1.5 mLチューブを使用することを推奨します。
速やかにセクションIIIに進んでください。

III. Concanavalin Aビーズと一次抗体の結合

実験開始前の準備：

!すべてのバッファーの量は、実施するCUT&RUN反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。

注意：細胞の透過化に用いるジギトニンの推奨量は過剰量であり、ほとんどの細胞株や組織を十分に透過化できます。ただし、すべての細胞株や組織が、ジギトニンに対して同じ感受性を示す訳ではありません。特定の細胞株や組織で推奨濃度のジギトニンが機能しない場合、Appendix Aのプロトコールに従って条件を最適化できます。ジギトニン処理により、細胞集団の>90%が透過化される必要があります。

注意：セクションIII-Vのすべてのインキュベーションステップにおいて、振盪または回転によってサンプルを攪拌させる必要はありません。チューブを指定の温度でラック上にただ静置するだけです。混合してもアッセイの性能は向上せず、むしろチューブ壁やキャップに付着することでビーズの凝集やビーズの損失を引き起こす可能性があります。

Digitonin Solution #16359を取り出して、90-100°Cで5分間温め、完全に解凍され溶解していることを確認してください。解凍したDigitonin Solution #16359は、すぐに氷上に置いてください。

注意：Digitonin Solution #16359は-20°Cで保管する必要があります。使用中は氷上で保持し、その日の使用が終了したら-20°Cで保管してください。
Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012と100X Spermidine #27287を取り出して温めてください。どちらも必ず完全に解凍してください。Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012はDMSO含有のため、氷上に置くと再凍結することに注意してください。
1反応につき、100X Spermidine #27287 1 µL + Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 0.5 µL + Digitonin Solution #16359 2.5 µL + Antibody Binding Buffer #15338 96 µLを調製し、氷上で保持してください (1反応につつき100 µL)。

セクションIのステップ7で調製済みの活性化したConcanavalin Aビーズを室温にし、ピペッティングで穏やかに上下させて十分に混合してください。
セクションII-Aのステップ6、セクションII-Bのステップ8、またはセクションII-Cのステップ15で調製した細胞に、1反応につきビーズ懸濁液10 µLを加えてください。
ピペッティングで上下させてサンプルを十分に混合してください。室温で5分間インキュベートしてください。
チューブを溶液が透明になるまで磁気ラックに置き (30秒間から2分間)、その後、液体を除去して廃棄してください。
チューブを磁気ラックから外してください。1反応につきAntibody Binding Buffer (+ Spermidine + PIC + Digitonin) 100 µLを加え、ピペッティングで上下に軽く混合し、氷上で保持してください。
1反応につき細胞とビーズの懸濁液100 µLを、別々の1.5 mLチューブに分注して氷上で保持してください。
各反応チューブに適量の抗体を加えて、ピペッティングで上下させて穏やかに混合してください。
注意：CUT&RUN反応に必要な抗体の量は様々です。お客様自身で決定してください。ポジティブコントロールのTri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit Monoclonal Antibody #9751の場合は、サンプルに抗体を2 µL加えてください。ネガティブコントロールのRabbit (DA1E) Monoclonal Antibody IgG Isotype Control (CUT&RUN) #66362の場合は、サンプルに抗体を5 µLを加えてください。「抗体なし」のコントロールでは、MNaseによる非特異的な高レベルの消化によりバックグラウンドが高くなるため、ネガティブコントロール抗体を使用することを強く推奨します。qPCR解析とNG-seq解析の両方で比較を行うために、インプットサンプルを使用することを推奨します。
チューブを4°Cで2時間、または室温で1時間インキュベートしてください。このステップは4°Cで一晩まで延長できます。

IV. pAG-MNase Enzymeの結合

実験開始前の準備：

!すべてのバッファーの量は、実施するCUT&RUN反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。

Digitonin Solution #16359を取り出して、90-100°Cで5分間温め、完全に解凍され溶解していることを確認してください。解凍したDigitonin Solution #16359は、すぐに氷上に置いてください。

注意：Digitonin Solution #16359は-20°Cで保管する必要があります。使用中は氷上で保持し、その日の使用が終了したら-20°Cで保管してください。
Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012と100X Spermidine #27287を取り出して温めてください。どちらも必ず完全に解凍してください。Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012はDMSO含有のため、氷上に置くと再凍結することに注意してください。
1反応につき、Digitonin Buffer 3.2 mL (10X Wash Buffer #31415 320 µL + 100X Spermidine #27287 32 µL + Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 16 µL + Digitonin Solution #16359 80 µL + Nuclease-free Water #12931 2.752 mL) を調製してください。

注意：ここで調製したDigitonin BufferをセクションIVとVの両方で使用します。
新しいチューブに、1反応につきDigitonin Buffer (上記) 50 µLとpAG-MNase Enzyme 1.5 µLを加え、pAG-MNaseプレミックスを調製してください。例えば反応10回分の場合は、Digitonin Buffer 500 µLを新しいチューブに移し、pAG-MNase Enzyme 15 µLを加えてください。ピペッティングで上下させて混合し、氷上で保持してください。

セクションIIIのステップ8で用いたチューブを溶液が透明になるまで (30秒間から2分間) 磁気ラックに置き、その後、液体を除去して廃棄してください。
チューブを磁気ラックから外し、Digitonin Buffer (+ Spermidine + PIC + Digitonin) 1 mLを加えてください。チューブの壁に張り付いたビーズを確実に回収できるように、穏やかに上下にピペッティングしてビーズを再懸濁してください。
チューブを溶液が透明になるまで磁気ラックに置き (30秒間から2分間)、その後、液体を除去して廃棄してください。
チューブを磁気ラックから外してください。各チューブにpAG-MNase溶液50 µLを加えて、ピペッティングで静かに上下させてサンプルを混合してください。
チューブを4°Cで1時間、インキュベートしてください。
速やかにセクションVに進んでください。

V. DNAの消化と拡散

実験開始前の準備：

!すべてのバッファーの量は、実施するCUT&RUN反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。

Digitonin Solution #16359を取り出して、90-100°Cで5分間温め、完全に解凍され溶解していることを確認してください。解凍したDigitonin Solution #16359は、すぐに氷上に置いてください。

注意：Digitonin Solution #16359は-20°Cで保管する必要があります。使用中は氷上で保持し、その日の使用が終了したら-20°Cで保管してください。
セクションIIで固定したサンプルを用いる場合は、10% SDS Solution #20533が完全に溶解していることを確認してください。37°Cに温めることでSDSの沈殿が溶解しやすくなります。
1反応につき、Digestion Buffer (セクションVで調製したDigitonin Buffer 148.5 µL + 塩化カルシウム1.5 µL) 150 µLを調製してください。使用するまで氷上で保持してください。
1反応につき、1X Stop Buffer (4X Stop Buffer #48105 37.5 µL + Digitonin Solution #16359 3.75 µL + RNAse A (10 mg/mL) #7013 0.75 µL + Nuclease-free Water #12931 108 µL) 150 µLを調製してください。

オプション：サンプルを正規化したい場合は、Yeast Normalization Spike-in DNAを1X Stop Bufferに加えてください (セクションVIIIの図8の例を参照してください)。qPCR解析の場合は、1反応につきYeast Spike-in DNAを5 µL (5 ng) 加えることを推奨します。NG-seq解析の場合、Yeast Normalization Spike-in DNAをNuclease-free Water #12931で100倍に希釈してから、1反応につきYeast Spike-in DNAを5 µL (50 pg) 加えることを推奨します。1反応につき100,000個の細胞または1 mgの組織を用いた場合は、Spike-in DNAのリード数は全シーケンシングリード数の約0.5%となります。1反応あたりに用いた細胞数や組織重量が約100,000個や1 mgよりも多いまたは少ない場合は、Spike-in DNAのリード数が全リード数の約0.5%になるように、比例計算でYeast Normalization Spike-in DNAの用量を調整してください。

セクションIVのステップ5で用いたチューブを溶液が透明になるまで (30秒間から2分間) 磁気ラックに置き、その後、液体を除去して廃棄してください。
チューブを磁気ラックから外してください。セクションIVで調製したDigitonin Buffer (+ Spermidine + PIC + Digitonin) 1 mLを加え、ピペッティングで穏やかに上下させてビーズを再懸濁してください。
チューブを溶液が透明になるまで磁気ラックに置き (30秒間から2分間)、その後、液体を除去して廃棄してください。
ステップ2-3をもう1度繰り返してください。
チューブを磁気ラックから外してください。各チューブにDigestion Buffer 150 µLを加え、ピペッティングにより上下させて混合し、pAG-MNaseを活性化してください。
サンプルを4°Cで30分間インキュベートしてください。
注意：消化は冷却ブロック上または冷蔵庫内で、4°Cで行う必要があります。氷を用いた場合は、温度が0°Cまで下がることがあり、これにより消化が制限されシグナルが低減する可能性があります。
各サンプルに1X Stop Buffer (+ Digitonin + RNAse A + Spike-in DNA [オプション]) 150 µLを加え、ピペッティングで上下させて混合してください。
チューブを振盪せずに37°Cで10分間インキュベートして、DNA断片を溶液中に放出させてください。
16,000 x gで2分間、4°Cで遠心分離して、チューブを溶液が透明になるまで磁気ラックに置いてください (30秒間から2分間)。
上清を新しい2 mL微量遠心分離用チューブに移してください。これが濃縮クロマチンサンプルになります。
注意：生細胞または新鮮組織 (未固定) をCUT&RUNアッセイに用いる場合は、ステップ11と12を省略して、直ちにステップ13に進んでください。

注意：固定したサンプルは後のプロトコールで65°Cでインキュベートするので、インキュベート中の蒸発を減少させるためセーフロックの付いた2 mLチューブを使用することを推奨します。
固定した細胞または組織サンプルの脱クロスリンクを行うため、サンプルを室温に戻した後、各サンプルに10% SDS Solution #20533 3 µL (最終濃度0.1%) およびProteinase K (20 mg/mL) #10012 2 µLを加えてください。
注意：サンプルが室温まで温められていない場合は、SDSが沈殿する可能性があります。
各サンプルをボルテックスで混合し、65°Cで少なくとも2時間インキュベートしてください。インキュベーションは一晩まで延長することができます。インキュベーション後、サンプルを10,000 x gで1秒間遠心して、チューブのキャップに付着した液体を回収してください。
サンプルの温度を室温に戻した後、セクションVIIに進んでください。(SAFE STOP) この状態で、サンプルは-20°Cで最長
1週間保存できます。ただし、DNAの精製 (セクションVII) に移る前に、サンプルを必ず室温に戻してください。

VI. インプットサンプルの調製

下流解析で次世代シーケンシング (NGS) を行う場合は、インプットDNAの断片化が必要ですが、qPCRの場合は必須ではありません。ソニケーターを利用できない場合に、qPCR解析ではインプットDNAを断片化せずに使用することを推奨しますが、断片化していないインプットDNAはサイズが大きすぎてDNAスピンカラムで精製できないので、フェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿で精製する必要があります。下流解析でNGSを行う際にソニケーターが利用できない場合は、正常IgGを用いたCUT&RUNサンプルをネガティブコントロールとして使用することもできますが、正常IgGでは非特異的にDNAが濃縮される場合があり、理想的ではありません。代替法となるMNaseを用いたインプットDNA断片化プロトコールを、cst-science.com/CUT-RUN-input-digestion で公開しています。

実験開始前の準備：

! すべてのバッファーの量は、調製するインプットサンプルの数に比例して増加させる必要があります。

CUT&RUN DNA Extraction Buffer #42015を取り出し、室温に戻してください。必ず完全に解凍してください。
1インプットサンプルにつき、次の量の混合液を調製してください： Proteinase K (20 mg/mL) #10012 2 µL + RNAse A (10 mg/mL) #7013 0.5 µL + 197.5 µL CUT&RUN DNA Extraction Buffer #42015 (1インプットサンプルあたり200 µL)。

セクションII-Aのステップ7、セクションII-Bのステップ9、またはセクションII-Cのステップ16からのインプットサンプル 100 µLに、CUT&RUN DNA Extraction Buffer (+ Proteinase K + RNAse A) 200 µLを加えてください。ピペッティングで上下させて混合してください。
最大1,200 rpmの中程度から強めで振とうしながら、チューブを55°Cで1時間インキュベートしてください。
チューブを5分間氷上で保持し、サンプルを完全に冷却してください。
インプットサンプルをソニケートし、細胞を溶解してクロマチンを断片化してください。ソニケーションの合間は、サンプルを氷上に30秒間置いてください。
注意：Appendix Bのプロトコールに従って様々なソニケーターの出力設定やソニケーション処理期間を試験するし、最適なソニケーションの条件を決定する必要があります。100-600 bpのサイズのクロマチン断片が生成される最適なソニケーションの条件を特定してください。VirTis Virsonic 100 Ultrasonic Homogenizer/Sonicator (1/8インチプローブ) であれば、出力を6に設定し、15秒パルスのソニケーションを5セット行うことで、インプットクロマチンは十分に断片化できます。
18,500 x gで10分間、4°Cで遠心分離し、ライセートを清澄化してください。上清を新しい2 mL微量遠心分離機用チューブに移してください。
速やかにセクションVII (DNAの精製) に進んでください。(SAFE STOP) ここでインプットサンプルを-20°Cで最長1週間保存できます。ただし、DNAの精製 (セクションVII) の前に、インプットサンプルを必ず室温まで戻してください。

VII. DNAの精製

DNAスピンカラム (セクションVII-A)、またはフェノール/クロロホルム抽出後エタノール沈殿法 (セクションVII-B) で、インプットや濃縮クロマチンサンプルからDNAを精製してください。DNAスピンカラムを用いた精製は簡便かつ迅速であり、35 bp超のDNA断片を効率良く回収できます (図7Aのレーン2を参照してください)。フェノール/クロロホルム抽出後のエタノール沈殿による精製は比較的煩雑ですが、35 bp未満のDNA断片も回収できます (図7Aのレーン3を参照してください)。ただし、図7Bに示すように、CUT&RUNアッセイで得られるほとんどのDNA断片は、35 bp以上になります。このため、DNAスピンカラムはCUT&RUN反応による全DNA断片の>98%を精製する、迅速かつ簡便な方法と言えます。

精製したDNAは、NG-seq解析に進む前にPicoGreenによるDNA定量アッセイで定量できます。100,000個の細胞を用いたCUT&RUN反応に期待されるDNAの収量は、転写因子やコファクターの場合は1反応あたり0.5-10 ng、ヒストン修飾の場合は1反応あたり1-20 ngです。

図7. DNA精製にスピンカラムを用いた場合と、フェノール/クロロホルム抽出後にエタノール沈殿を用いた場合を比較しました。(A) 低分子量のDNAラダー混合物 (レーン1、未精製) を、 DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP、CUT&RUN、CUT&Tag) #14209 (レーン 2)、あるいは、フェノール/クロロホルム抽出後のエタノール沈殿 (レーン3) により精製し、4%アガロースゲルを用いた電気泳動により分離しました。図に示すように、フェノール/クロロホルム抽出後のエタノール沈殿はすべてのサイズのDNA断片を効率的に回収しますが、DNAスピンカラム法では≥35 bp以上のDNA断片を回収します。 (B) TCF4/TCF7L2 (C48H11) Rabbit Monoclonal Antibody #2569を用いたCUT&RUN アッセイで得られたDNAを、フェノール/クロロホルム抽出後のエタノール沈殿で精製しました。その後、ライブラリーのDNA断片のサイズを、 Bioanalyzer (Agilent Technologies) を用いて解析しました。ライブラリー構築中に付加されたアダプターやバーコード配列は、DNA断片のうちの140 bpを占めます。そのため、最初は35 bpであったDNA 断片の長さは、ライブラリー調製の後は175 bpになります (図中の青い縦線をご覧ください)。ここに示すように、断片の長さが175 bp以下 (開始長は35 bp以下) であるのはCUT&RUNで濃縮される全DNA断片の2%未満であり、 CUT&RUNで得られるDNAの >98%をスピンカラム法で効率的に回収できることが分かります。

A. スピンカラムを用いたDNAの精製

注意：DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP、CUT&RUN、CUT&Tag) #14209 (本キットには含まれません) を下記の改変プロトコールに用いることにより、インプットサンプルや濃縮クロマチンサンプルからDNAを精製できます。インプットクロマチンサンプルと濃縮クロマチンサンプル 300 µLに、5倍量のDNA Binding Buffer (1.5 mL) を加える方法に沿って、ステップ1から5までを改変しています。

実験開始前の準備：

!! 使用前に、DNA Wash Bufferにエタノール (96-100%) 24 mLを加えてください。このステップは、DNA精製を開始する際に1回のみ行ってください。

精製する1濃縮クロマチンサンプルまたは1インプットサンプル1インプットサンプルにつき、DNA Purification Columnとコレクションチューブを1セット準備してください。

各インプットサンプルまたは濃縮クロマチンサンプルにDNA Binding Buffer 1.5 mLを加え、ピペッティングで上下させて混合してください。
注意：1サンプルあたり5倍量のDNA Binding Bufferを使用します。
ステップ1のサンプル600 µLをそれぞれ、コレクションチューブにセットした各DNAスピンカラムに移してください。
18,500 x gで30秒間遠心分離してください。
コレクションチューブから各スピンカラムを取り外し、液体を廃棄してください。空になったコレクションチューブにスピンカラムを再度セットしてください。
ステップ1のサンプル全量がスピンカラムで遠心分離されるまで、ステップ2-4を繰り返してください。空になったコレクションチューブにスピンカラムを再度セットしてください。
DNA Wash Buffer 750 µLをコレクションチューブにセットした各スピンカラムに加えてください。
18,500 x gで30秒間遠心分離してください。
コレクションチューブから各スピンカラムを取り外し、液体を廃棄してください。空になったコレクションチューブにスピンカラムをセットしてください。
18,500 x gで30秒間遠心分離してください。
コレクションチューブと液体を廃棄してください。スピンカラムは廃棄しないでください。
スピンカラムにDNA Elution Buffer 50 µLを加え、清潔な1.5 mLチューブにセットしてください。
18,500 x gで30秒間遠心分離して、DNAを溶出してください。
各DNAスピンカラムを取り外し、廃棄してください。得られた溶出液が精製されたDNAです。(SAFE STOP) サンプルは、-20°Cで最長6か月間保存できます。

B. フェノール/クロロホルム抽出後にエタノール沈殿を使用したDNAの精製

注意：フェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈殿に必要な以下の試薬は、本キットには含まれていません：フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール (25:24:1)、クロロホルム/イソアミルアルコール (24:1)、3M酢酸ナトリウム (pH 5.2)、グリコーゲン 20 mg/mL、100%エタノール、70%エタノールおよび1X TEバッファーまたはNuclease-free Water #12931

フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール (25:24:1) 300 µLをインプットサンプルと濃縮クロマチンサンプルに加え、30秒間ボルテックスして十分に混合してください。
16,000 x gで5分間遠心分離して、層状に分離させてください。上部の水層の大部分を (中間層を避けて) 慎重に回収し、新しいチューブに移してください。
クロロホルム/イソアミルアルコール (24:1) 300 µLを水層サンプルに加え、30秒間ボルテックスして十分に混合してください。
16,000 x gで5分間遠心分離して、層状に分離させてください。上部の水層の大部分を (中間層を避けて) 慎重に回収し、新しいチューブに移してください。
3 M酢酸ナトリウム (pH 5.2) 25 µL、20 mg/mLグリコーゲン 1 µL、100%エタノール 600 µLを各水層サンプルに加え、30秒間ボルテックスして混合してください。
-80°Cに1時間、あるいは-20°Cに一晩置いて、DNAを沈殿させてください。
4°C、16,000 x gで5分間遠心分離して、DNAをペレットにしてください。
上清を慎重に除去して廃棄し、70%エタノールでペレットを洗浄してください。
4°C、16,000 x gで5分間遠心分離して、DNAをペレットにしてください。
上清を除去し、ペレットを風乾してください。
1X TEバッファーまたはNuclease-free Water #12931 50 µLにペレットを再懸濁してください。これが精製されたDNAです。(SAFE STOP) サンプルは、-20°Cで最長6か月間保存できます。

VIII. qPCRによるDNAの定量

推奨事項：

本キットに含まれるYeast Normalization Primer Setは、出芽酵母のACT1遺伝子を増幅するプライマーセットであり、酵母に由来するYeast Normalization Spike-in DNAを定量することによりサンプルを正規化できます。
キットにはコントロールプライマーとしてヒトあるいはマウスのRPL30遺伝子 (#7014あるいは#7015) が含まれており、Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit Monoclonal Antibody #9751サンプルの定量的リアルタイムPCRに使用できます。他の生物種でCUT&RUNを実施する場合は、その生物種に適切なコントロールプライマーを設計し、最適なPCR条件を決定してください。
プライマーの設定は非常に重要です。CUT&RUNの場合は、PCR増幅産物のサイズは約60-80 bpとなるように設計してください。プライマーをデザインする際は、融解温度は約60°C、GC含量は約50%となるように設計してください。
qPCRでヒストンや転写因子、コファクターの標的遺伝子を定量する場合は、qPCRに用いる精製DNAは2 µLで十分です。
非特異的なPCR産物の増幅を防ぐため、ホットスタート用Taqポリメラーゼの使用を推奨します。
コンタミネーションを防ぐため、フィルターチップ付きピペットチップを使用してください。

使用するPCR装置のモデルに対応するPCRチューブあるいはPCRプレートに、適切なサンプル番号を記載してください。PCR反応には、ポジティブコントロールのtri-methyl-histone H3 Lys4サンプル、ネガティブコントロールのRabbit IgGサンプル、DNAコンタミネーションに対するコントロールとしてDNAなしのチューブ、インプットDNAサンプルを含めてください。必要に応じて、インプットDNAの段階希釈 (未希釈-100%インプット、1:5-20%インプット、1:25-4%インプット、1:125-0.8%インプット) を用いて標準曲線を作成し、増幅効率を決定して各免疫濃縮サンプル内のDNA量を定量してください。
注意：サンプルの正規化を実施する場合、Yeast Normalization Primer Setを用いて解析できるのはCUT&RUNサンプルのみです。インプットDNAにYeast Spike-in DNAは含まれません。
各PCRチューブまたはPCRプレートの各ウェルに、DNAサンプル 2 µLを分注してください。

下記の通り、マスターミックスを調製してください。各PCR反応に、2つまたは3つの複製サンプルを作成してください。損失を考慮して、十分な量のマスターミックスを調製してください (1-2反応分を多めに調製してください)。各PCRチューブまたは各ウェルにマスターミックス18 µLを加えてください。

試薬	PCR反応1回の分量 (18 µL)
Nuclease-free H₂O #12931	6 µL
5 µMのプライマー	2 µL
SimpleChIP^{^®} Universal qPCR Master Mix #88989	10 µL

PCR反応を以下のプログラムで開始してください：
1. 初期変性　95°C 3分間
2. 変性　95°Cで15秒間
3. アニーリングおよび伸長　60°Cで60秒間
4. ステップbからdを繰り返し、計40サイクル反応させてください。
リアルタイムPCR装置に付属のソフトウェアを使用して、定量結果を解析してください。代替法として、Percent Input法により下記の公式を用いて、免疫沈降の効率を算出することもできます。この方法では、各抗体反応で回収されたシグナルを、インプットクロマチン総量の割合 (%) で示します。インプットDNAサンプルの段階希釈を使用する場合、% Input (100%、20%、4%、0.8%) のLog(10) に対する標準曲線を作成し、これを用いて各抗体反応で得られたシグナルを算出します。
- Percent Input = 100% x 2^{(C[T] 100% Input Sample - C[T] IP Sample)}
- C[T] = Ct = Cq = PCR反応の平均閾値サイクル
サンプルを正規化する際は、Yeast Normalization Primer SetのC[T]値が最も低いサンプルを基準サンプルとして選択してください (例：下表のサンプル1)。次の公式を用いてその他のサンプルすべての正規化係数を算出してください。算出した正規化係数を用いて、各プライマーセットから得られたシグナルを調整してください。

**qPCR解析におけるサンプルの正規化の例 (図8を参照してください)**
	Yeast Primer SetのC[T]値	**qPCRの正規化係数	正規化前のシグナル (ステップ5で算出したPercent Input)	正規化後のシグナル
サンプル1	23.31	2^{(23.31-23.31)}=1.00	24.4%	24.4%/1.00=24.4%
サンプル2	24.24	2^{(23.31-24.24)}=0.52	12.0%	12.0%/0.52=23.1%
サンプル3	25.08	2^{(23.31-25.08)}=0.29	6.28%	6.28%/0.29=21.7%
サンプル4	26.30	2^{(23.31-26.30)}=0.13	2.72%	2.72%/0.13=20.9%

**qPCRの正規化係数 = 2^{(C[T] 選択したサンプル – C[T] その他のサンプル)}

図8. Spike-in DNAを用いてqPCR解析で CUT&RUNシグナルを正規化しました。異なる数のHCT116細胞に対して、Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit Monoclonal Antibody #9751 (上のパネル) あるいはPhospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit Monoclonal Antibody #13499 (下のパネル) を用いて、CUT&RUNを実施しました。濃縮DNAを、human GAPDH exon 1 primers、SimpleChIP^® Human β-Actin Promoter Primers #13653、SimpleChIP^® Human β-Actin 3' UTR Primers #13669, 、SimpleChIP^® Human MyoD1 Exon 1 Primers #4490を用いて、リアルタイムPCRで解析しました。各サンプルにおける免疫沈降されたDNA量を、100,000個の細胞からのインプットクロマチン総量に対する相対シグナルで示しています。正規化前の濃縮の結果を左のパネルに示しています。初期の細胞数に比例した量のYeast Normalization Spike-in DNAを各反応に加えました。Yeast Normalization Primer Setを用いて測定したSpike-in DNAのqPCRシグナルの差を基に、CUT&RUN シグナルを100,000個の細胞を含むサンプルの値に正規化しました。正規化された濃縮の結果を右のパネルに示しています。

IX. NGSライブラリーの構築

本キットを用いて調製した免疫濃縮DNAサンプルは、NG-seqに直接使用できます。NG-seq用のDNAライブラリーの調製には、下流のシーケンシングプラットフォームに対応するプロトコールやキットを使用してください。Illuminaシステムのプラットフォームによるシーケンシングの場合は、DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795を、Multiplex Oligos for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580または#47538と共に、CUT&RUN DNAのプロトコールに従って使用することを推奨します。

CUT&RUNのバックグラウンドシグナルは非常に低いため、通常はヒストン修飾や転写因子の解析のシーケンシング深度は、1サンプルあたり500万リードで十分です。シーケンシング深度が1サンプルあたり1,500万以上の場合、リードの重複率が大幅に上昇します。シーケンシング深度が1サンプルあたり200万以下の場合、S/N比が低下します。
使用した細胞数が20,000未満の場合は、一般にNGSで得られるリードのマッピング率が低下し、重複率が上昇します。このような場合には、下流のデータ解析に十分なユニークマップリード数を得るために、シーケンス深度を増やすことを推奨します。
サンプルを正規化するために、全てのサンプルのCUT&RUNシーケンシングデータを、試験ゲノム (例えば、ヒト、マウス、その他) および出芽酵母 (S. cerevisiae) ゲノム (例えば、sacCer3) の両方にマッピングしてください。酵母でユニークリード数が最も少ないサンプルを選択し (例：下表のサンプル1) をリファレンスサンプルとして選択し、以下の式を用いてその他のサンプルの正規化係数を算出してください。これらの係数をバイオインフォマティクス解析に適用し、各サンプルの試験ゲノムにマッピングされたユニークリード数をダウンサンプリングしてください。シーケンシング深度がサンプル間で著しく異なる場合は、Spike-inのリードの絶対数ではなく、Spike-inのリード数と総リード数の比率を用いて正規化係数を算出できます。

**NGS解析におけるサンプルの正規化の例**
	酵母にアラインメントしたユニークリード数	正規化係数 NGS用	解析対象のリファレンスゲノムにアラインメントしたユニークリード数 (正規化前)	解析対象のリファレンスゲノムにアラインメントしたユニークリード数 (正規化後)
サンプル1	219,275	219,275/219,275 = 1.00	5,077,747	5,077,747 X 1.00 = 5,077,747
サンプル2	411,915	219,275/411,915 = 0.53	9,896,671	9,896,671 X 0.53 = 5,268,306
サンプル3	816,235	219,275/816,235 = 0.27	17,842,773	17,842,773 X 0.27 = 4,793,320
サンプル4	1,120,826	219,275/1,120,826 = 0.20	23,836,679	23,836,679 X 0.20 = 4,663,339

NGSの正規化係数 = 基準サンプル中の酵母のユニークリード数 / その他のサンプル中の酵母のユニークリード数

APPENDIX A：細胞のジギトニンに対する感受性の決定

CUT&RUNのプロトコールでは、バッファーにジギトニンを添加して細胞膜の透過化を行い、一次抗体やpAG-MNase酵素が細胞や核に進入できるようにします。そのため、抗体と酵素の結合および標的ゲノム遺伝子座の消化を成功させるには、バッファーに適量のジギトニンを含めることが不可欠です。各細胞株は、ジギトニンによる細胞透過化に対して異なる感受性を示します。本プロトコールで推奨されているジギトニンの量は、ほとんどの細胞株や組織の透過化に十分ですが、下記のプロトコールを用いて、使用する特定の細胞株や組織のジギトニン感受性試験を行うこともできます。ジギトニンの過剰添加は、アッセイに対して有害ではないことが分かっているため、濃度曲線を作成する必要はありません。推奨されるジギトニンの量が使用する細胞株に対して十分な量であるかどうかは、簡単な試験で判断できます。

実験開始前の準備：

Digitonin Solution #16359を取り出して90-100°Cで5分間温め、完全に解凍されて溶解していることを確認してください。解凍したDigitonin Solution #16359は、すぐに氷上に置いてください。

注意：Digitonin Solution #16359は-20°Cで保管する必要があります。使用中は氷上で保持し、その日の使用が終了したら-20°Cで保管してください。
1細胞または1組織サンプルにつき、Wash Buffer (10X Wash Buffer #12931 10 µL + Nuclease-free Water #12931 90 µL) を100 µL調製してください。この試験には、100X Spermidine #27287やProtease Inhibitor Cocktail (200X) #7012を加える必要はありません。

1.5 mLチューブに10,000-100,000個の細胞を回収します。組織の場合は、1 mgの組織から乖離した細胞を回収します (セクションII-Cのステップ1-15)。
600 x gで3分間、室温で遠心分離し、液体を除去して廃棄してください。
注意：細胞ペレットが肉眼で確認できない場合は、ステップ2で細胞懸濁液を最初に遠心分離した後、ペレットを崩さない程度になるべく多くの培地を除去し、1反応につき細胞培地を≤40 µL残すことを推奨します。次のステップ3で、適量の1X Wash Bufferを加え、細胞懸濁液の総量を100 µLにしてください。
Wash Buffer 100 µLに細胞ペレットを再懸濁してください。
1反応につき、Digitonin Solution #16359を2.5 µL加え、室温で10分間インキュベートしてください。
細胞懸濁液10 µLと0.4%トリパンブルー色素10 µLを混合してください。
血球計算盤またはセルカウンターを使用して、染色された細胞数と細胞総数を計測してください。透過化が十分であれば、>90%の細胞がTrypan Blueで染色されます。
90%以下の細胞しかトリパンブルーで染色されなかった場合は、ジギトニンバッファーに加えるDigitonin Solution #16359の量を増やして、>90%の細胞が透過化され染色されるまで、ステップ1-5を繰り返してください。セクションIII-Vでは、この量のDigitonin Solution #16359を使用してください。

APPENDIX B：インプットサンプルのソニケーションの最適化

DNAスピンカラムを使用して精製できるのは、断片化されたゲノムDNA (< 10 kb) だけであることから、インプットDNAサンプルのソニケーションを推奨します。断片化されたゲノムDNA (< 1 kb) は、NG-seq解析でネガティブコントロールとして使用できます。インプットDNAの長さが100-600 bpになるように、ソニケーション条件を最適化する必要があります。

NG-seqのコントロールには、インプットサンプルを使用することを推奨します。インプットサンプルは、偏りのない細胞ゲノムの代表として簡便に使用できるからです。IgGサンプルもNG-seqのネガティブコントロールとして使用できますが、非特異的な結合によりゲノムの特定領域の濃縮が得られる場合があります。qPCR解析の場合は、インプットDNAを断片化せずに使用できます。ただし、断片化されていないDNAは、フェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿によって精製する必要があります。

実験開始前の準備：

! すべてのバッファーの量は、調製するインプットサンプルの数に比例して増加させる必要があります。

CUT&RUN DNA Extraction Buffer #42015を取り出して室温に戻し、完全に解凍されて溶解していることを確認してください。
1インプットサンプルにつき、1X Wash Buffer (10X Wash Buffer #31415 210 µL + Nuclease-free Water #12931 1.89 mL) を2.1 mL調製し、細胞へのストレスを最小限にするため、室温に戻してください。この試験には、100X Spermidine #27287やProtease Inhibitor Cocktail (200X) #7012を加える必要はありません。
1インプットサンプルにつき、次の量の混合液を調製してください：Proteinase K µ#10012 2 &L + RNAse A (10 mg/mL) #7013 0.5 µLを加え、CUTRUN DNA Extraction Buffer #42015 197.5 µLとしてください (1インプットサンプルにつき200 µL)。

1.5 mLチューブ中に、検討するソニケーション条件に1反応につき、CUT&RUN実験で使用するインプットと同じ数の細胞 (5,000-100,000細胞) を回収してください。組織の場合は、各ソニケーション条件あたり、CUT&RUN実験で使用するインプットと同じ量の組織から解離させた細胞を回収してください (セクションII-Cのステップ1-15)。
600 x gで3分間、室温で遠心分離し、液体を除去して廃棄してください。
注意：使用する細胞数が少なく (<100,000細胞)、遠心分離で集めた細胞ペレットが肉眼で確認できない場合は、下記ステップ3-5の洗浄操作を省略することを推奨します。ステップ2で細胞懸濁液を最初に遠心分離した後、ペレットを崩さない程度にできる限り多くの培地を除去し、≤40 µL程度の細胞培地を残すことを推奨します。この場合、ステップ6で細胞懸濁液に適量の1X Wash Bufferを加え、各ソニケーション条件の1反応あたりの合計容量を100 µLにしてください。
1X Wash Buffer 1 mLを加えて、ピペッティングで穏やかに上下させて細胞ペレットを再懸濁してください。
600 x gで3分間、室温で遠心分離し、液体を除去して廃棄してください。
ステップ3と4を繰り返して、もう1度細胞ペレットを洗浄してください。
各ソニケーション条件の1反応につき、1X Wash Buffer 100 µLを加え、穏やかにピペッティングで上下させて細胞ペレットを再懸濁してください。
細胞懸濁液100 µLを、ソニケーション条件ごとに新しいチューブに分注してください。
注意：このサンプルは、ステップ9で55°Cでインキュベートするため、インキュベート中の蒸発を低減させるためにセーフロックの付いた1.5 mLチューブを使用することを推奨します。
各サンプルにCUT&RUN DNA Extraction Buffer (+ Proteinase K + RNAse A) 200 µLを加えて、ピペッティングで上下させて混合してください。
最大1,200 rpmの中程度から強めで振とうしながら、チューブを55°Cで1時間インキュベートしてください。
チューブを5分間氷上で保持し、サンプルを完全に冷却してください。
お使いのソニケーターにおける最適なソニケーション条件を決定するには、15秒間のパルスソニケーションのサイクル数を増加させながら、タイムコース実験を実施してください。ソニケーション処理の合間は、サンプルを氷上に30秒間置いてください。
18,500 x gで10分間、4°Cで微量遠心分離機を用いて遠心分離して、ライセートを清澄化してください。上清を新しい2 mL微量遠心分離用チューブに移してください。
セクションVIIに従って、DNAスピンカラム法またはフェノール/クロロホルム抽出後エタノール沈殿で、DNAサンプルを精製してください。
カラムからDNAを溶出するか、DNAペレットを1X TEバッファーまたはNuclease-free Water #12931 30 µLで再懸濁してください。
電気泳動でDNA断片のサイズを決定してください。100 bp DNAマーカーと共に>15 µLのサンプルを、1%アガロースゲルにロードしてください。ゲル上のDNAスメアがよくみえるように、色素フリーのローディングバッファー (30%グリセロール) の使用を推奨します。
最適なサイズである100-600 bpのDNA断片が得られるソニケーション条件を選択して、セクションVIのステップ4のインプットサンプル調製を実施してください。最適なソニケーション条件が得られない場合は、ソニケーターの出力設定あるいはソニケーションのサイクル数を増減させて、ソニケーションのタイムコース実験を繰り返してください。

APPENDIX C：トラブルシューティングガイド

詳細なトラブルシューティングガイドについては、cst-science.com/troubleshooting-CUT-RUNをご覧ください。

APPENDIX D：オンラインリソース

CUT&RUNアッセイに関する見て分かるプロトコール、セミナー、ポスター、ブログ、FAQ、詳細情報については、CUT&RUNリソースセンター (cellsignal.com/applications/cut-and-run) にアクセスするか、以下のQRコードをスキャンしてご覧ください。